Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Benita Grünther

Etablierung eines kompetitiven Ovidukt-Explant-

Assays zur Bestimmung der

Eileiterbindungsfähigkeit konservierter

Eberspermien in vitro

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110531

title (eng.)

Establishment of a competitive oviduct explant assay to determine the binding capacity of preserved boar spermatozoa to oviductal cells in vitro

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/gruentherb_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Studie war die Etablierung eines kompetitiven Ovidukt-Explant-Assays (OEA) zur Bestimmung der Bindungsfähigkeit von Eberspermien an Eileiterepithelzellen in vitro sowie der Einsatz dieses Assays zur Überprüfung des Konservierungserfolges bei hypotherm gelagerten Eberspermien.

Ejakulate von elf verschiedenen institutseigenen Ebern wurden gewonnen, aufbereitet und für 72 Stunden gelagert. Für den OEA wurden Eileiterexplante von geschlachteten Altsauen verwendet. In Versuch 1.1 des ersten Teils der Studie wurde der Einfluss einer Spermienfärbung mit Hoechst 33342 und nachfolgender Percollzentrifugation auf Motilität, Membranintegrität und Bindungsindex im OEA sowie kompensatorische Effekte eines Zusatzes von 10  % Seminalplasma im Verdünnermedium untersucht. Für den Erhalt der Motilität und der Bindungsfähigkeit ist unabhängig von der Lagerungsdauer ein Zusatz von Seminalplasma nach Percollzentrifugation zwingend erforderlich. Bezüglich der Membranintegrität konnte diese Notwendigkeit nicht nachgewiesen werden. In den Versuchen 1.2 und 1.3 wurde der Einfluss der Farbstoffe MitoTracker® Green FM und MitoTracker® Red FM und deren Lösungsmittel Dimethylsulfoxid auf die Motilität und die Membranintegrität bei einer Lagerungsdauer von 24 Stunden getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass weder die Farbstoffe noch das Lösungsmittel einen negativen Effekt auf die Motilität oder die Membranintegrität hatten (p > 0,05) und die Farbstoffe somit für einen kompetitiven Assay einsetzbar sind. In Versuch 1.3 wurden zusätzlich unterschiedliche Koinkubationszeiten der Explante mit den unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Spermien verglichen. Die Resultate zeigen, dass nach 45 Minuten Koinkubationszeit zwar insgesamt mehr Spermien gebunden haben, aber dass nach 15 Minuten Koinkubationszeit das erwartete Verhältnis von 1:1 zwischen grünen und roten gebundenen Spermien auftrat.

Im zweiten Abschnitt der Studie wurde der kompetitive OEA bei 5°C vergleichend zu 17°C gelagerten Spermien angewendet. Dabei ergab sich die Notwendigkeit einer Inkubation der bei 5°C gelagerten Proben bei 38°C bevor sie im OEA eingesetzt wurden. Nach 72 Stunden Lagerung war kein Unterschied im Bindungsverhältnis zwischen 5°C und 17°C gelagerten Probe festzustellen (p > 0,05). Allerdings war die durchflusszytometrisch bestimmte Reaktivität auf den Kapazitationsstimulus Bikarbonat bei 5°C gelagertem Sperma signifkant geringer (p < 0,05). Weitere spermatologische Parameter, wie Motilität, Membranintegrität, Mitochondrienmembranpotential und Spermienchromatinstabilität, erwiesen sich als wenig sensitiv zur Darstellung des Lagertemperatureffekts.

Schlussfolgernd ist festzustellen, dass mit dem in dieser Studie etablierten kompetitiven Ovidukt-Explant-Assay ein sensitiver Parameter für die Untersuchung konservierter Eberspermien zur Verfügung steht. Mit dem Assay wurde eine hohe Eileiterbindungsfähigkeit von hypotherm konservierten Eberspermien aufgezeigt, die für die weitere Entwicklung innovativer Konservierungskonzepte in der Schweinebesamung von Bedeutung ist.

abstract (englisch)

The aim of this study was to establish a competitive oviduct explant assay (OEA) to determine the binding capacity of boar spermatozoa to oviductal cells in vitro. The assay was then used to test the effect of hypothermic storage of boar semen on sperm-oviduct binding in vitro.

Ejaculates of eleven institute-owned boars were collected, processed and stored for 72 h. For the OEA, oviductal explants from slaughtered sows were used. In trial 1.1 of the first part of this study, the influence of sperm staining with Hoechst 33342 and subsequent Percoll centrifugation on motility, membrane integrity and binding index in the OEA was investigated. Additionally, compensatory effects of an addition of 10 % seminal plasma in the extender medium were examined. The use of seminal plasma was indispensable for the maintenance of motility in centrifuged semen. Membrane integrity was not affected by centrifugation stress. In trials 1.2 and 1.3, the influence of MitoTracker® Green FM and MitoTracker® Red FM dyes and their solution medium Dimethylsulfoxid on motility and membrane integrity of spermatozoa stored for 24 h was investigated. Results demonstrate that neither the dyes nor the solution medium affect motility or membrane integrity (p > 0.05). Thus, both dyes are useable for the competitive assay. In trial 1.3, additionally different co-incubation lengths were tested. It was shown that more sperm bound after 45 minutes co-incubation, whereas the expected relation of 1:1 between green and red bound sperm was found after 15 minutes of co-incubation time.

In the second part of this study, the competitive OEA was used to compare sperm binding after storage at 5°C and 17°C. It was demonstrated that sperm stored at 5°C must be incubated at 38°C before addition to the oviductal explant to reveal the full binding capacity. There was no difference between the binding ratio of sperm stored for 72 h at 5°C and 17°C (p > 0.05). However, the specific reactivity to the capacitation stimulus bicarbonate was reduced in semen samples stored at 5°C (p < 0.05). Other sperm traits, such as motility, membrane integrity, mitochondria membrane potential and sperm chromatin stability, were insensitive to semen storage temperature.

In conclusion, in the present study a competitive oviduct explant assay was established which allows sensitive analysis of storage effects in liquid preserved boar semen. The assay revealed a high sperm oviduct binding capacity of hypothermic stored boar spermatozoa and opens further perspectives for the development of innovative preservation strategies in artificial insemination of pigs.

keywords

Eberspermien, Eileiter, Spermakonservierung ; boar spermatozoa, oviduct, sperm preservation

kb

9.888