Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Anne Granitzny

In vitro/ex vivo liver models for the prediction

of idiosyncratic drug-induced liver injury

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110521

title (ger.)

In vitro/ex vivo Modelle der Leber zur Prädiktion der idiosynkratischen arzneimittelinduzierten Hepatotoxizität

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/granitznya_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Arzneimittelinduzierte Leberschädigung (engl.: drug-induced liver injury (DILI)) ist die häufigste Ursache für die Zulassungsverweigerung eines Medikaments oder dessen Rücknahme vom Markt. Hierbei stellt die seltene, aber äußerst schwerwiegende, idiosynkratische Form ein Hauptproblem in der Arzneimittelentwicklung dar. Grund hierfür ist das Fehlen von Lebermodellen, welche in der Lage sind die schwer fassbaren Eigenschaften von idiosynkratischen Reaktionen in vivo und in vitro widerzuspiegeln. Eine Vorhersage dieser oft tödlichen Nebenwirkungen ist daher zurzeit nicht möglich und führt dazu, dass diese häufig erst nach der Zulassung erkannt werden. Demzufolge besteht ein dringender Bedarf an Lebermodellen, die es ermöglichen in den frühen nicht-klinischen Phasen der Arzneimittelentwicklung festzustellen, ob ein Arzneimittelkandidat idiosynkratische DILI auslösen kann. Nur dann können risikobehaftete Kandidaten von einer weiteren Entwicklung ausgeschlossen werden bevor sie auf den Markt gelangen.

 

Entsprechend der ‚Inflammatorischen Stress Hypothese‘ (engl.: Inflammatory Stress Hypothesis) spielen Wechselwirkungen zwischen parenchymalen Hepatozyten mit nicht-parenchymalen Zellen, wie leberständigen Makrophagen und infiltrierenden Monozyten, sowie Entzündungsepisoden eine entscheidende Rolle bei der Modulation der individuellen Anfälligkeit gegenüber idiosynkratischer DILI. Lebermodelle, die alle relevanten Zelltypen aufweisen und dadurch die Kommunikation zwischen den verschiedenen Zelltypen ermöglichen, würden die Vorhersage von idiosynkratischer DILI und unser Verständnis für diese Krankheit verbessern. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurden in dieser Arbeit zwei hochrelevante Lebermodelle etabliert. Zum einen ein in vitro Ko-Kultur Modell auf der Grundlage immortalisierter Leber- und Immunzellen, die durch eine poröse Membran getrennt werden, und zum anderen ex vivo Leberdünnschnitte (engl.: precision cut liver slices (PCLiS)) der Ratte, die ihre ursprüngliche Leberarchitektur mit allen natürlich vorkommenden Zelltypen beibehalten.

 

Das Ko-Kultur Modell, welches humane Hepatomzellen (HepG2) mit humanen monozytären oder Makrophagen-ähnlichen THP-1-Zellen kombiniert, wurde mit vier Arzneimittelpaaren behandelt. Diese bestanden jeweils aus einem Arzneimittel, welches idiosynkratische DILI auslöst (Troglitazone, Trovafloxacin, Diclofenac, Ketoconazole) und einer Partner-Verbindung aus der gleichen Substanzklasse, die kein Potential hat idiosynkratische DILI auszulösen (Rosiglitazone, Levofloxacin, Acetylsalicylsäure, Fluconazole). Die Arzneimittel wurden zum Vergleich in der HepG2 Mono- oder Ko-Kultur in Gegenwart oder Abwesenheit eines pro-inflammatorischen Hintergrundes getestet (induziert durch LPS oder TNF). Somit wurden neun verschiedenen Expositionsszenarien pro Medikament untersucht. Durch die Bestimmung der Viabilität der HepG2-Zellen anhand des WST-1 Assays nach 24-48h Exposition war es möglich Arzneimittel zu identifizieren, die eine Gefahr für das Auslösen einer idiosynkratischen DILI darstellen. Drei von vier „idiosynkratischen Arzneimitteln“ (Troglitazone, Diclofenac und Ketoconazole) wurden in HepG2-Zellen durch das alleinige Hinzufügen von entweder Monozyten oder Makrophagen nachgewiesen. Hierbei zeigte Troglitazone eine erhöhte Zytotoxizität in HepG2-Zellen im Vergleich zum Kontroll-Szenario, Diclofenac und Ketoconazole eine hormetische Stressantwort. Außerdem waren drei von vier „idiosynkratischen“ Arzneimitteln (Diclofenac, Trovafloxacin und Ketoconazole) in HepG2-Zellen durch eine erhöhte Zytotoxizität nachweisbar, wenn sie mit LPS-stimulierten Monozyten oder Makrophagen ko-kultiviert wurden. Zu guter Letzt waren alle Arzneimittel in HepG2-Monokulturen durch die Ko-exposition mit dem pro-inflammatorischen Zytokin TNF nachweisbar. Wichtig ist, dass alle beschriebenen idiosynkratischen Reaktionen mit den entsprechenden Partnerverbindungen nicht beobachtet wurden. Diese Ergebnisse bestätigen, dass das alleinige Hinzufügen von Immunzellen, und insbesondere das Vorliegen einer entzündlichen Umgebung, die Empfindlichkeit von Leberzellen gegenüber Verbindungen, die das Potential haben eine idiosynkratische DILI auszulösen, erhöhen. Medikamente, die eine idiosynkratische Reaktion in HepG2-Zellen durch das alleinige Hinzufügen von Immunzellen induzieren, müssen zudem in der Lage sein eine sekundäre Reaktion der Immunzellen auszulösen, welche die Leberzellen gegenüber einer Arzneimitteltoxizität sensibilisiert. Da alle „idiosynkratischen Arzneimittel“ in dem Ko-Expositionsszenario mit dem pro-inflammatorischen Faktor TNF nachweisbar waren, deuten die Ergebnisse darüber hinaus auf eine vorherrschende Rolle dieses Zytokins bei der Auslösung der idiosynkratischen DILI hin.

 

Die Eigenschaften des zweiten Modells, die Leberdünnschnitte, machen dieses zu einem idealen System um multizelluläre Phänomene, wie die (idiosynkratische) Hepatotoxizität, abzubilden. Die Handhabung der Schnitte variiert jedoch beträchtlich zwischen den Labors, sodass die Routineanwendung dieses wertvollen Modells, und damit auch die Vergleichbarkeit der Ergebnisse, in der nicht-klinischen Testung erschwert werden. In dieser Arbeit wurden deshalb ein leicht zugänglicher Kultur-Aufbau, sowie ein Kultur-System und ein Protokoll entwickelt, welche zusammen genommen die optimale Viabilität und Funktionalität der Leberdünnschnitte gewährleisten und zusätzlich ermöglichen spezifische in vivo Endpunkte zu reproduzieren. Die Qualität der inkubierten Rattenleberdünnschnitte wurde während einer 24-stündigen Kulturperiode unter Verwendung von zehn Messparametern beurteilt. Diese umfassten Viabilitäts- (LDH-, AST- und GLDH-Freisetzung sowie ATP-Gehalt) und Funktionalitätsparameter (Harnstoff- und Albuminproduktion) sowie die Histomorphologie und andere deskriptive Parameter (Proteingehalt, Nassgewicht und Schnittdicke). Während der begrenzten Inkubationszeit von 24h wurden eine hohe Viabilität und die Aufrechterhaltung der leberspezifischen Funktionen sichergestellt. Anhand der Exposition von Leberdünnschnitten mit ansteigenden Konzentrationen des bekannten Hepatotoxins Acetaminophen wurden der ATP-Gehalt, die Albuminproduktion und die Histomorphologie als die empfindlichsten Parameter zur Überwachung von hepatotoxischen Reaktionen in Rattenleberdünnschnitten identifiziert. Die Ergebnisse bestätigen, dass Leberdünnschnitte unter standardisierten Bedingungen für Toxizitätsstudien eingesetzt werden können und eine wertvolle Alternative aber auch Ergänzung zu herkömmlichen Zellkulturmodellen darstellen.

abstract (englisch)

Drug-induced liver injury (DILI) is the most common cause for the non-approval of a drug or its withdrawal from the market. Especially the rare, but particularly severe, idiosyncratic form represents a major issue in drug development because there are no liver models available that are capable of reflecting the elusive characteristics of idiosyncratic responses in vivo and in vitro. This is why they are often not detected until post-approval. Thus, a prediction of these often fatal adverse side reactions is currently not possible. Consequently, there is an urgent need for liver models that allow to screen drug candidates for their potential to induce idiosyncratic DILI in the early non-clinical drug development process and to eliminate drug candidates that are likely to induce these severe adverse side reactions before they enter the market.

 

According to the inflammatory stress hypothesis, interactions between parenchymal hepatocytes with non-parenchymal cells, such as liver resident macrophages and infiltrating monocytes, as well as inflammatory episodes play a critical role in the alteration of an individual’s susceptibility to idiosyncratic DILI. Liver models that possess all relevant cell types, and thereby allow to study the communication between the different cell types, would improve the prediction of idiosyncratic DILI and our understanding for this disease. To face this need, two highly relevant liver models were established in this thesis. On the one hand, an in vitro liver co-culture model based on immortalized liver and immune cells separated by a porous membrane and, on the other hand, ex vivo precision-cut liver slices (PCLiS) from the rat that retain their original liver architecture with all naturally occurring cell types.

 

The co-culture model, combining human hepatoma HepG2 cells with either human monocytic or macrophage-like THP-1 cells, was treated with four drug pairs, each consistent of a drug that is known to induce idiosyncratic DILI (troglitazone, trovafloxacin, diclofenac, ketoconazole) and partner compound from the same substance class that has no potential to induce idiosyncratic DILI (rosiglitazone, levofloxacin, acetylsalicylic acid, fluconazole). The drugs were tested in HepG2 mono- or co-culture and in the presence or absence of a pro-inflammatory background (induced by LPS or TNF) for comparison, resulting in nine different exposure scenarios. By determining the liver cell viability after 24-48h exposure via the WST-1 assay, drugs with the risk of inducing idiosyncratic DILI were identified. Three out of four idiosyncratic drugs (troglitazone, diclofenac and ketoconazole) were detected in HepG2 cells by the sole addition of either monocytes or macrophages. Troglitazone showed an increased cytotoxicity in HepG2 cells when compared to the control scenario, diclofenac and ketoconazole a hormetic stress response. In addition, three out of four idiosyncratic drugs (diclofenac, trovafloxacin and ketoconazole) were detectable in HepG2 cells by an increased cytotoxicity when co-cultured with LPS-stimulated monocytes or macrophages. And finally, all drugs were identified as idiosyncratic positive in HepG2 monocultures when co-exposed to the pro-inflammatory cytokine TNF. Importantly, all described idiosyncratic responses were not observed with the corresponding partner compounds. These findings confirm that the sole addition of immune cells and especially an inflammatory environment can increase the sensitivity of liver cells towards compounds that have the potential to induce idiosyncratic DILI. Drugs that induced an idiosyncratic response in HepG2 cells by the sole addition of immune cells must be able to induce a secondary response by the immune cells that sensitizes the liver cells to the drug toxicity. Since all idiosyncratic drugs were detectable in the co-exposure scenario with the pro-inflammatory factor TNF, the results moreover point to a predominant role of this cytokine as an initiator of this rare disease.

 

The characteristics of the second model, the PCLiS, make them to an ideal model to reflect multicellular phenomena such as (idiosyncratic) hepatotoxicity. However, the management of the slices varies considerably between laboratories impeding the routine use of this valuable model, as well as the comparability of results, in the non-clinical testing procedure. Hence, an easily accessible culture setup, system and protocol, which together ensure optimal slice viability and functionality, in order to accurately reproduce in vivo outcomes, were established in this thesis. The quality of the incubated rat PCLiS was assessed during a 24h culture period using ten readouts, which covered viability (LDH, AST and GLDH leakage as well as ATP content) and functionality parameters (urea and albumin production) as well as histomorphology and other descriptive characteristics (protein content, wet weight and slice thickness). A high overall slice viability and maintenance of liver-specific functions was ensured during this limited incubation period. By exposing the liver slices to increasing concentrations of the known hepatotoxicant acetaminophen, the ATP content, the albumin production and the histomorphology were identified as the most sensitive parameters to monitor hepatotoxic responses in rat PCLiS. The results confirm that PCLiS can be used under standardized conditions for ex vivo toxicity tests of liver toxicants and represent a valuable alternative to standard cell culture models.

keywords

Idiosynkratische arzneimittelinduzierte Hepatotoxizität, Ko-Kultur Modell der Leber, Leberdünnschnitte, Idiosyncratic drug-induced liver injury, Liver co-culture model, Precision-cut liver slices

kb

17.142