Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Christine Gesterding, geb. Schütz

Einfluss von Zell- und Bakterienkulturüberständen

auf die In-vitro-Differenzierung

boviner Makrophagen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106407

title (engl.)

The effect of cell culture supernatants and bacteria on the in vitro differentiation of bovine macrophages

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/gesterdingc_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Makrophagenplastizität ist ein wesentlicher Bestandteil einer funktionierenden Erregerabwehr, wobei die gereiften Makrophagen vielfältige Aufgaben von der Erregereliminierung bis hin zur Resolution einer Entzündung und der Gewebeneubildung übernehmen. Die Steuerung der Makrophagen-Funktion, deren Polarisierung, wird von Mediatoren beeinflusst, die sowohl von körpereigenen Gewebezellen als auch von Pathogenen selbst gebildet werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde diese Situation in vitro mithilfe von Zell- und Bakterien-Kulturüberständen simuliert und deren Einfluss auf Monozyten sowie auf ihre Reifung zu Makrophagen untersucht. Da bei Milchkühen ein gehäuftes Auftreten von E.‑coli-Erkrankungen während der Transitperiode zu beobachten ist, wurden zur bakteriellen Stimulation verschiedene E.‑coli-Isolate verwendet. Ferner handelt es sich überwiegend um Faktorenkrankheiten. Daher wurden weitere Parameter wie der relativ zur Geburt gelegene Blutentnahmezeitpunkt, die Körperkondition, die Laktations­zahl der Tiere und deren Gesundheitsstatus bei der Auswertung der Daten berücksichtigt.

Sowohl uterine Stromazell-Kulturüberstände als auch Kulturüberstände von uterinen Epithelzellen waren in der Lage Monozyten zu aktivieren. Sie induzierten einen unmittelbaren, konzentrationsabhängigen Kalziumeinstrom. Hierbei hatten Überstände E.‑coli-Lipopolysaccharid (LPS) ‑stimulierter Stromazellen eine stärkere Wirkung als solche unstimulierter Zellen. Dies ließ vermuten, dass die aktivierenden Mediatoren stimulations­abhängig gebildet werden. Die Reifung zu Makrophagen unter dem Einfluss von Stromazellüberständen führte zu keinen veränderten phänotypischen und funktionellen Eigenschaften der Zellen. Die Expressionsstärke der Oberflächen­moleküle CD16, CD11b, CD163 und MHC-Klasse-II blieb unverändert, ebenso die Kapazität der Zellen zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Kulturüberstände der geprüften E.-coli-Isolate wiesen Unterschiede in der Stärke des induzierten Kalziumeinstroms auf. Überstände der E.-coli-Isolate der Phylogruppe A wie auch die Überstände von E.-coli-Isolaten aus dem Uterus und der Milchdrüse von Tieren mit Endometritis oder Mastitis induzierten eine starke Monozyten­aktivierung. Makrophagen, die aus Monozyten in Anwesenheit von E.‑coli-Überständen in vitro reiften, wiesen eine signifikant verringerte Expression von CD16, CD163 und MHC‑Klasse‑II-Molekülen auf. Zudem zeigten die Makrophagen eine verstärkte ROS-Bildung.

Auch das Genexpressionsprofil der gereiften Makrophagen wurde von E.‑coli-Überständen beeinflusst. Die Gene CXCL1, CXCL8 und NOS2 wurden signifikant, die Gene IL10 und IL1B tendenziell stärker exprimiert. Ebenso wie der modulierte Oberflächen-Phänotyp lässt der gleichzeitige Anstieg von IL10 und NOS2 keine Schlüsse auf eine drastische Polarisierung der Makrophagen durch die E.‑coli-Überstände in Richtung M1- oder M2-Makrophagen zu. Der Expressionsanstieg von CXCL1 und CXCL8 zeigte, dass unter E.‑coli-Sekretom gereifte Zellen dazu angeregt wurden, chemotaktische Faktoren zu sezernieren, die neutrophile Granulozyten anlocken und aktivieren; ein Hinweis auf eine inflammatorische Ausrichtung der Zellen.

Das Chemokin CCL5 und LPS, Mediatoren, die in der Regel auch in erhöhter Konzentration im entzündeten Gewebe vorliegen, wurden zur Kontrolle bei den Versuchen ebenfalls als Stimuli verwendet. Während LPS keinen Kalziumeinstrom in Monozyten auslöste, war der Einfluss auf die Makrophagenreifung ähnlich der Wirkung der E.‑coli-Überstände, wenngleich die induzierten Veränderungen schwächer waren. Demgegenüber hatte CCL5, das einen deutlichen Kalziumeinstrom in Monozyten auslöste, einen gegenteiligen Effekt auf die Genexpression boviner Monozyten-gereifter Makrophagen (MdM). CCL5-gereifte Makrophagen exprimierten die Gene IL1B und NOS2 signifikant und die Gene CXCL1 und CXCL8 tendenziell schwächer als Medium-gereifte-MdM. Möglicherweise entwickeln sich Makrophagen unter dem Langzeiteinfluss des inflammatorischen Chemokins zu anti-inflammatorisch ausgerichteten Subtypen, um die Gefahr von Gewebsschädigungen zu verringern.

Der Zeitpunkt der Monozytengewinnung in der Transitperiode hatte keinen Einfluss auf die Oberflächenexpression von CD16, MHC-Klasse-II und CD163, jedoch wurde CD11b gegen Tag 56 post partum zunehmend schwächer exprimiert. Die Fähigkeit zur ROS-Bildung war vom relativ zur Geburt gelegenen Entnahme­zeitpunkt abhängig. So wiesen vor der Geburt differenzierte MdM eine signifikant stärkere Kapazität zur ROS-Bildung auf als nach der Geburt differenzierte Zellen. MdM von Tieren mit unterschiedlichen Körperkonditionen wiesen keine signifikanten Unterschiede in ihren phänotypischen und funktionellen Eigenschaften auf. Die durch E.‑coli-Überstand induzierte, reduzierte Expression von CD16 und MHC‑Klasse‑II auf gereiften MdM war bei Tieren mit postpartalen Infektionserkrankungen stärker ausgeprägt als bei klinisch gesunden Tieren. Funktionell unterschieden sich die MdM der Tiere mit unterschiedlichen postpartalen Gesundheitszuständen nicht. Vergleiche zwischen MdM erstlaktierender Kühe mit denen mehrfachlaktierender Tiere zeigten keine signifikanten Unterschiede im Phänotyp und der Funktionalität dieser Zellen.

Die sensiblere Reaktion von Monozyten postpartal erkrankter Tiere auf den Kontakt mit E.‑coli-Sekretom kann nicht sicher als Ursache oder Folge der Infektions­erkrankung bestimmt werden. Die zum Teil konträren Wirkungen von Wirts­mediatoren (hier: CCL5) und bakteriellen Produkten auf die phänotypische und funktionelle Modulation der aus Monozyten entstandenen Makrophagen eröffnen eine Möglichkeit zur Einflussnahme auf die Monozyten-Makrophagen-Differenzierung. Da die Gesamt-Reaktivität des Gewebes nach Erreger­kontakt von dieser Differenzierung abhängt, können die in dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse langfristig zu neuen Ansätzen der Metritis- und Mastitis­prävention durch eine gezielte Modulation der Monozyten-Makrophagen-Differenzierung führen.

abstract (englisch)

Taking over crucial tasks from the initial elimination of pathogens to the resolution of inflammation and tissue regeneration, macrophages and their plasticity are an essential component of a well-functioning immune system. Polarization of macrophages is affected by secreted mediators of endogenous cells as well as by the secretome of invaded bacteria. In this study, the impact of supernatants (SN) from bovine cell cultures and E. coli bacteria on monocytes and their in vitro differentiation into macrophages was analyzed. Dairy cows show a distinct susceptibility towards E. coli infection during the transition period. Since the outcome of these infections is determined by several variables, day of blood collection, body condition, lactation number and health status of the animals were taken into account.

To examine whether the SN have the ability to activate monocytes, calcium influx in monocytes was measured during stimulation with SNs of bovine uterine stromal cells and uterine epithelial cells. Both supernatants induced a concentration-dependent Ca2+-influx. Since SNs of lipopolysachharid (LPS) -treated stromal cells had a stronger effect than those of unstimulated stromal cells, it can be assumed that the substances which led to this activation were induced by stimulation. E. coli SNs differed in their ability to induce Ca2+-influx. SNs from phylogroup A isolates and those from E. coli which were isolated from cows with endometritis and mastitis had the strongest impact. Whilst in vitro differentiation of monocytes into macrophages was not influenced by the secretome of stromal cells, macrophages differentiated under the influence of E. coli SNs showed a significantly reduced expression of surface CD16, CD11b and MHC‑class‑II. In addition, their capacity to generate reactive oxygen species (ROS) was enhanced.

Monocyte/macrophage differentiation in the presence of E. coli SNs had an effect on gene expression profiles of monocyte-derived macrophages (MdM). Gene expression of CXCL1, CXCL8 and NOS2 was significantly, the expression of IL10 and IL1B was in tendency enhanced in stimulated MdM. Neither the modulated surface phenotype nor the simultaneous increase in IL10 and NOS2 gene expression provide evidence for a preferential polarization by E. coli supernatants towards M1 or M2 macrophages. The increased gene expression of CXCL1 und CXCL8 indicates that cells stimulated by E. coli SNs secrete chemotactic mediators which attract and activate neutrophils.

The chemokine CCL5 and LPS are usually present in enhanced concentrations in inflamed tissue. They were used as stimuli in this study as well. Whilst LPS did not induce Ca2+-influx in monocytes, it had an influence on macrophage differentiation similar to but less intense than the effect of E. coli SNs. In comparison, CCL5 was capable to induce a strong Ca2+-influx in monocytes. Its influence on the gene expression profile of MdM was just the opposite of the effects induced by E. coli. Macrophages stimulated with CCL5 showed a significantly lower expression of the genes IL1B and NOS2 and in tendency lower expression of CXCL1 and CXCL8 compared to unstimulated cells. Hypothetically, macrophages maturing under the influence of CCL5 become anti-inflammatory cells to diminish the risk of tissue damage.

The day relative to parturition of monocyte isolation had no effect on the MdM surface expression of CD16, MHC-class‑II and CD163. However, the expression of CD11b became significantly lower towards day 56 post partum. The ability of the cells to produce ROS was dependent on the day of blood collection. It was significantly higher in macrophages derived from monocytes, which were isolated during pregnancy than from MdM generated from monocytes taken after birth. Both Body Condition Score and the lactation number of the cows had no significant effect on phenotypic and functional properties of macrophages while the health status affected their phenotype. The decreased expression of CD16 induced by E. coli SNs was more pronounced on MdM from animals with post partal infectious diseases than on cells from healthy cows. In contrast, the ability to generate ROS was not influenced by the health status.

Whether the more sensitive reaction of MdM isolated from animals with post partal diseases is a reason or a consequence of the disease cannot safely be assumed. The in part contrary effect of host mediators (CCL5) and bacterial products on the modulation of phenotype and function of monocyte-derived macrophages may point to new ways of manipulating macrophage differentiation. As tissue damage after pathogen exposure also depends on this differentiation, the findings of this study may support new concepts in mastitis and endometritis prevention.

keywords

Überstände, Transitperiode, Makrophagen, Supernatants, Transit Period, Macrophages

kb

881