Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Birthe Gericke

 

 Molecular basis of the heterogeneity in congenital sucrase-isomaltase deficiency

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109026

title (ger.)

Die molekulare Basis der Heterogenität bei kongenitaler Saccharase-Isomaltase-Defizienz

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/gerickeb_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Kohlenhydrate sind wesentliche Bestandteile der menschlichen Ernährung und werden während der Passage durch den Gastrointestinaltrakt in ihre Bestandteile, die Monosaccharide zerlegt. Die freigesetzten Monosaccharide, überwiegend Glukose, können als Energiequelle für den menschlichen Körper genutzt werden. Saccharase-Isomaltase (SI) ist ein Enzymkopmlex, der in der Bürstensaummembran des menschlichen Dünndarms verankert ist und maßgeblich zum letzten Schritt des Kohlenhydratverdaus und der Freisetzung von Glukose beiträgt. SI ist ein Typ II Transmembranprotein, das aus zwei funktionellen Untereinheiten, der Isomaltase und der Saccharase, besteht und entlang des sekretorischen Transportweges gebildet und transportiert wird. Defekte der Saccharase-Isomaltase führen zu Kohlenhydratmalabsorption, welche oftmals mit dem klinischen Erscheinungsbild einer osmotischen Diarrhoe sowie Bauchschmerzen und Krämpfen bei Patienten einhergeht. Eine Form von Kohlenhydratmalabsorption ist die kongenitale Saccharase-Isomaltase-Defizienz (CSID), die durch Veränderungen im SI-Gen ausgelöst wird. CSID ist als seltene und autosomal-rezessiv vererbte Krankheit beschrieben, die durch eine verminderte oder nicht vorhandene Aktivität des SI-Proteins charakterisiert ist. Die dem Verdau von Nahrungskohlenhydraten unterliegenden physiologischen und pathophysiologischen molekularen Prozesse im Menschen sind nicht komplett erforscht und wurden in dieser These mit dem Fokus auf SI genauer untersucht. Der erste Teil der vorliegenden These beschäftigt sich mit der Untersuchung, der molekularen Pathogenese von 15 SI-Genmutationen, die in CSID Patienten mit reduzierter oder defizienter SI Aktivität gefunden wurden. Diese Untersuchung wurde in einem in vitro Zellmodell durchgeführt. Alle 15 Punktmutationen wurden in der kodierenden Region des SI-Gens gefunden und führten zu der Translation von SI-Proteinvarianten mit einzelnen Aminosäureaustauschen und in zwei Fällen zu der Einführung eines Terminationscodons. Der Effekt der jeweiligen Genmutationen auf die Funktion des resultierenden SI-Proteins, spiegelt sich in drei hier definierten biosynthetischen Phänotypen wieder. Eine physiologische Funktion des SI-Proteins erfordert verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich des intrazellulären Proteintransports und der Faltung in eine aktive Proteinstruktur. Mutationen, die durch intrazelluläre Blockade und Inaktivierung des SI-Proteins zu einem kompletten in vitro Funktionsverlust der SI führen, wurden in den biosynthetischen Phänotyp III gruppiert und wiesen die höchste molekulare Pathogenität auf. Übereinstimmend mit den molekularen Daten ist in den Dünndarm-Biopsieproben der CSID Patienten mit Mutationen des Phänotyps III keine SI Aktivität messbar gewesen. Mutationen, die zu dem biosynthetischen Phänotyp I oder II führen, gehen mit einer reduzierten enzymatischen Aktivität und einem normalen bis verzögerten Transport der SI-Proteinvarianten einher und haben jeweils milde oder mittelschwere Einflüsse auf die in vitro SI Funktion. Einige SI-Proteinvarianten des Phänotyps II oder III sind enzymatisch aktiv, werden aber nicht oder nur vermindert zur Zelloberfläche transportiert, was diese Proteinvarianten zu potentiellen Kandidaten zum Test einer pharmakologischen oder chemischen Chaperon-Therapie für CSID in der Zukunft macht. Eine mögliche Chaperon-Therapie für CSID könnte eine Alternative oder ein Zusatz zur Enzymersatztherapie oder der strikten Reduktion von Saccharose und Stärke in der Ernährung von CSID Patienten sein, um die Aktivität von SI im Darmlumen wieder herzustellen oder zu erhöhen. Der zweite Teil der These befasst sich mit der Analyse der katalytischen Spezifitäten von SI in einem Zellsystem. Der Fokus war dabei auf zwei Asparaginsäureresten (D) an Aminosäurepositionen 604 (D604) und 1500 (D1500) innerhalb der aktiven Zentren von SI mit potentieller Funktion als Protonendonor. Der separate experimentelle Austausch dieser Aminosäuren in den aktiven Zentren führte zu einem kompletten Verlust der Enzymaktivität der durch die Mutation betroffenen SI Untereinheit, während die Aktivität der jeweils anderen Untereinheit nicht verändert war. Diese Ergebnisse zeigen, dass D604 und D1500 in den beiden aktiven Zentren von SI eine essentielle Rolle in der Substartkatalyse spielen und bestätigen ihre Funktion als Protonendonor. Die resultierenden Proteinvarianten mit nur einer aktiven Untereinheit bieten ein gutes Modell, um die enzymatischen Kapazitäten jeder SI Untereinheit einzeln zu studieren. Diese Analysen führten zu der Entdeckung einer möglichen Produktinhibition von SI durch Glukose. Dieser Mechanismus könnte daran beteiligt sein, die Glukosefreisetzung durch den Kohlenhydratverdau im Dünndarm zu kontrollieren und den Glukoselevel im Blut zu regulieren. Zusammengefasst bietet die vorliegende These Einblicke in die katalytischen Eigenschaften und Mechanismen der humanen SI im Kohlenhydratverdau und in die molekulare Grundlage der Fehlfunktion von SI in CSID und zeigt neue mögliche Ansatzpunkte für eine entsprechende Therapie auf.

abstract (englisch)

Carbohydrates are essential components of the human diet and are broken down into their building monosaccharides during transit through the gastrointestinal tract. The monosaccharides, mainly glucose, can then be utilized as energy sources for the human body. Sucrase-isomaltase (SI) is an enzyme complex anchored in the small intestinal brush border membrane that essentially contributes to the final step of carbohydrate digestion and the release of glucose. SI is a highly glycosylated type II integral membrane protein that consists of two functional subunits, isomaltase and sucrase. The SI protein is synthesized in the rough endoplasmic reticulum and is transported along the secretory pathway to the cell surface. Defects of SI cause carbohydrate malabsorption that oftentimes goes along with a clinical onset of osmotic-fermentative diarrhea, abdominal pain and cramps in patients. Congenital sucrase-isomaltase deficiency (CSID) is a form of carbohydrate malabsorption elicited by genetic alterations in the SI gene. The disease is described as rare autosomal recessively inherited disorder that is characterized by reduced or absent activities of SI. The molecular processes underlying dietary carbohydrate digestion in human health and disease with focus on SI are not fully understood and will be studied in this thesis.

The first part of this thesis investigates the molecular pathogenesis of 15 SI mutations, found in CSID patients with reduced or absent α-glyosidic activities of SI, in a cellular in vitro model system. The 15 single nucleotide polymorphisms target the coding region of the SI gene and result in protein variants with single amino acid exchanges and in two cases in the introduction of a chain termination codon. The effect of the genetic alteration on the SI protein function, involving different cellular processes like protein trafficking and folding into an active conformation, was reflected by the definition of three biosynthetic phenotypes in our study. With a complete loss of in vitro SI protein function by intracellular blockage and enzymatic inactivation, that is matching to absent activities in patients’ biopsies, mutations grouped in biosynthetic phenotype III had the highest molecular pathogenic potential. Mutations grouped in biosynthetic phenotypes I and II lead to mild to intermediate effects on the SI function by reduced activities and a normal to delayed trafficking to the cell surface. Some mutations from phenotype II and III were enzymatically active but not properly trafficked, rendering them as potential candidates to test chemical or pharmacological chaperone therapy for CSID in future, alternatively or additionally to enzyme replacement therapy or nutritional restrictions to restore the SI activities at the cell surface.

The second part of the thesis elucidates the SI catalytic site properties under physiological conditions in a cellular system. Here, the focus was on two aspartic acid residues (D) at amino acid positions 604 (D604) and 1500 (D1500) within the isomaltase and sucrase catalytic sites, with predicted proton donor functions. The experimental mutational replacement of aspartic acid in the conserved catalytic site motifs of SI led to a complete loss of activities of the targeted SI subunit, while the activities of the respective other subunit was not influenced. These data indicate that D604 and D1500 in the two catalytic sites of SI have an essential role in substrate catalysis by SI and prove the proton donor function of these residues. The generated single active site variants of SI provided a good model to study enzymatic capacities of both SI subunits separately. The proportion of maltose digestion carried out by each subunit was not known so far. The sucrase subunit showed a higher maltose digestive capacity compared to the isomaltase subunit. Increased combined activities of both single-active site variants lead to the investigation of product inhibition of SI. In fact, analysis of SI activities in human brush border membrane preparations revealed a reduction of both sucrase and isomaltase activities under addition of glucose, suggesting product inhibition as new mechanism for SI. This so far undescribed mechanism of SI may function to regulate the glucose release from carbohydrate digestion in the intestine and balance the blood glucose level.

Taken together, this thesis provides insights into the catalytic properties and mechanisms of human SI during carbohydrate digestion and into the molecular basis of an impaired human SI function during the pathogenesis of CSID and may help to find new targets for therapy.

keywords

Sucrase-isomaltase, congenital sucrase-isomaltase deficiency, carbohydrate malabsorption, Saccharase-Isomaltase, Kongenitale Saccharase-Isomaltase-Defizienz, Kohlenhydratmalabsorption

kb

4.072