Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Sandra Gelhaus

Analyse der zytoplasmatischen Domäne eines Alphacoronavirus Spike-Proteins und ihrer Funktion beim Zusammenbau von Viruspartikeln

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104747

title (engl.)

Analysis of the cytoplasmic domain of an Alphacoronavirus Spike protein and its function during virus assembly 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/gelhauss_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Coronaviren (CoV) sind behüllte Viren mit einem positiv-orientierten RNA-Genom. Das Virus der übertragbaren Gastroenteritis der Schweine (TGEV) ist ein Vertreter der Alphacoronaviren. Innerhalb der Hülle von TGEV liegen drei Glykoproteine vor, das Spike (S)-, das Membran (M)- und das Envelope (E)-Protein. Das S-Protein ist verantwortlich für die Bindung an den zellulären Rezeptor und die anschließende Fusion von viraler und zellulärer Membran während des Viruseintritts. Der Einbau des S-Proteins in Viruspartikel erfolgt durch die Interaktion mit dem M-Protein. Innerhalb der zytoplasmatischen Domäne des TGEV S-Proteins befinden sich ein cysteinreiches Motiv (CRM) und ein tyrosinbasiertes Retentionssignal, das für die Retention am Ort des Viruszusammenbaus (Endoplasmatische Retikulum-Golgi-intermediäre Kompartiment, ERGIC) sorgt. CRMs in membrannahen Proteinsequenzen werden oft post-translational palmitoyliert. Studien an anderen Coronaviren konnten bereits zeigen, dass die Palmitoylierung des S-Proteins wichtig sein kann für die CoV-Infektiösität, die Zell-Zell-Fusion, die S-M-Proteininteraktion oder beim Einbau des S-Proteins in Viruspartikel. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des CRM des TGEV S-Proteins während des Zusammenbaus von TGEV-Partikeln und die Rolle des CRM und des tyrosinbasierten Retentionssignals bei der S-M-Proteininteraktion untersucht. Um essentielle Cysteine innerhalb des CRM, zu identifizieren wurden verschiedene Cys-Mutanten kloniert. Mit Hilfe von VLP(Virusähnliche-Partikel)-Assays konnte gezeigt werden, dass eine volle Cys-Mutante nicht in VLPs eingebaut wird, partielle Cys-Mutanten hingegen schon. Die Lage der Cysteine spielte dabei keine Rolle. Durch metabolische Markierung mit 3H-Palmitinsäure konnte gezeigt werden, dass die volle Cys-Mutante palmitoylierungsdefizient ist, die partiellen Mutanten allerdings acyliert werden. Die S-M-Proteininteraktion war bei der palmitoylierungsdefizienten Mutante jedoch nicht beeinträchtigt, wie in Koexpressions-Studien in Immunfluoreszenzanalysen gezeigt werden konnte. Des Weiteren konnte durch Konfokalmikroskopie gezeigt werden, dass Mutationen innerhalb des S-Proteins, die eine Retention des Proteins verhindern, ebenfalls keinen Einfluss auf die Interaktion mit dem M-Protein hatten. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Palmitoylierung des S-Proteins wichtig ist für dessen Einbau in Viruspartikel und dass der S-M-Proteininteraktion und dem S-Proteineinbau beim Zusammenbau von TGE-Viruspartikeln unterschiedliche Bedingungen zu Grunde liegen.

abstract (englisch)

Coronaviruses (CoV) are a family of enveloped, single-stranded, positive-sense RNA viruses. The transmissible gastroenteritis virus (TGEV), an Alphacoronavirus that represents an enteropathogenic CoV of swine is the subject of this work. Three different glycoproteins, the spike (S), the membrane (M) and the envelope (E) protein are incorporated into the envelope of TGE virions. The CoV S protein is required for attachment to the cellular receptor and for subsequent membrane fusion with the host cell membrane. The incorporation of S is achieved by its interaction with the viral M protein during assembly. A conserved cysteine-rich motif (CRM) and a tyrosin-based retention signal are located in the cytoplasmic domain of the TGEV S protein, which leads to the retention of S at the CoV budding site the ERGIC (endoplasmic reticulum-golgi intermediate compartment). Cysteine-rich regions in a membrane proximal area present a potential site for palmitoylation. Previous studies on other CoVs have already shown that palmitoylation can be crucial for infectivity, S-M protein interaction, cell-cell fusion and S incorporation into virus particles. This work aims to study the role of the S protein CRM during TGE virion assembly and the role of the CRM and the tyrosin-based retention signal in S-M protein interaction. To map the crucial cysteine residues in the S protein, various cysteine residue substitutions were introduced within the CRM. A virus-like particle (VLP) assay was performed to investigate the incorporation ability of these cysteine-mutants. It has been observed that the complete substitution of all ten cysteine-residues in the CRM prevented the incorporation of S into VLPs. However, partial cysteine-mutants were still able to incorporate into VLPs. Above all, it made no difference which cysteines were substituted. We further demonstrated by metabolic labeling with 3H-palmitic acid that in contrast to the partial cysteine mutants the complete cysteine mutant of S is palmitoylation-deficient. However, the S-M protein interaction was not impaired with the non-palmitoylated S mutant. Furthermore, it was shown by confocal microscopy that mutations affecting the intracellular retention of the S had no influence on the S-M protein interaction. Taken together, these results demonstrate that the palmitoylation of S is essential for S incorporation into TGE virions and that the requirements for S incorporation differ from those for S-M protein interaction during TGEV assembly.

keywords

TGEV Spike-Protein, Viruszusammenbau, Palmitoylierung; TGEV Spike protein, virus assembly, palmitoylation

kb

7.678