Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Theresa Gather

Übertragungswege und Infektionsverlauf des nicht-primaten Hepacivirus, des equinen Pegivirus 1 und des Theiler’s Disease Associated Virus beim Pferd

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109014

title (engl.)

Routes of transmission and course of infection of the nonprimate Hepacivirus, the equine Pegivirus 1 and the Theiler’s Disease Associated Virus in horses

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/gathert_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Vor wenigen Jahren wurden neue pferdespezifische Viren der Familie Flaviviridae beschrieben. Infektionen mit dem nicht-primaten Hepacivirus (NPHV) und equinen Pegivirus 1 (EPgV 1) sind weit verbreitete Virusinfektionen bei Pferden, wohingegen das Theiler’s disease associated virus (TDAV) bisher selten nachgewiesen wurde. NPHV repräsentiert den phylogenetisch nächsten Verwandten des Hepatitis-C-Virus (HCV) des Menschen. In ersten Studien wurde auch für NPHV ein Lebertropismus festgestellt und bei infizierten Pferden konnten subklinische Hepatitiden diagnostiziert werden. Die Pathogenese und Übertragungswege der neu beschriebenen Viren sind jedoch noch unklar.

Ziel der der vorliegenden Arbeit war es, potentielle Übertragungswege zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf der vertikalen Transmission lag. Zu dem Zweck wurden 20 Vollblutstuten und ihre Fohlen während der Abfohlsaison 2015 untersucht. Den Stuten wurde in den letzten Tagen vor der Geburt Blut abgenommen und während den Geburten wurde Nabelschnurblut aufgefangen, die fetale Plazenta beprobt und eine Kolostrumprobe gewonnen. Den Fohlen wurde ca. 14 Stunden nach der Geburt Blut entnommen. Die Proben wurden mit Hilfe eines Luziferase-Immunpräzipitations-Systems und einer quantitativen Real-Time PCR auf das Vorhandensein von anti-NPHV-NS3-Antikörpern (Ak) und NPHV-RNA untersucht. Zusätzlich wurden die Proben mit einer quantitativen Multiplex RT-PCR bezüglich EPgV 1-RNA und TDAV-RNA untersucht. Um die klinische Bedeutung der Virusinfektionen zu charakterisieren, wurden leberspezifische Parameter bestimmt und klinische Allgemeinuntersuchungen durchgeführt.

Das TDAV konnte in keiner der Proben nachgewiesen werden, so dass mögliche Übertragungswege nicht näher untersucht werden konnten. Es waren jedoch vier der Stuten präpartal EPgV 1-RNA-positiv. Da keines der Fohlen postnatal EPgV 1-RNA im Serum hatte, konnte die Möglichkeit der vertikalen Übertragung von EPgV 1 in dieser Studie weder bestätigt noch sicher ausgeschlossen werden.

Das NPHV wurde jedoch bei einem Stuten-Fohlen-Paar vertikal übertragen. Insgesamt waren präpartal 80 % der Stuten anti-NPHV-NS3-Ak-positiv und bei vier der seropositiven Stuten konnte zusätzlich NPHV-RNA im Blut nachgewiesen werden. Eines der Fohlen hatte NPHV-RNA im postnatalen Serum und dieses Stuten-Fohlen-Paar war das einzige mit RNA-positivem Nabelschnurblut. Das Nabelschnurblut aller anderen Stuten-Fohlen-Paare war ebenso wie die am ersten Lebenstag entnommenen Blutproben der Fohlen NPHV-negativ. Der Zeitpunkt des Virusnachweises im Fohlenblut direkt nach der Geburt legt eine intrauterine Infektion des Fetus nahe. Eine Sequenzierung der im Serum- und Nabelschnurblut nachgewiesenen NPHV-RNA im E1/E2 Bereich des Genoms zeigte identische NPHV-Varianten im Blut des Fohlens und im Nabelschnurblut, die jedoch leichte Unterschiede zu der NPHV-Variante im maternalen Blut aufwiesen. Diese Ergebnisse lassen eine intrauterine Flaschenhals-Infektion des Fetus mit wenigen maternalen Quasispezies vermuten. Die Plazenta der Stute war äußerlich und in der pathohistologischen Untersuchung unauffällig, so dass eine Entzündung der Plazenta im Zusammenhang mit einer NPHV Infektion zum Zeitpunkt der Geburt und in der späten Trächtigkeit unwahrscheinlich ist. Die Übertragung der anti-NPHV-NS3-Ak von den Stuten an ihre Fohlen erfolgte über das Kolostrum, da das Nabelschnurblut der seropositiven Stuten Antikörper-negativ, das Serum der Fohlen nach Kolostrumaufnahme hingegen Antikörper-positiv war.

Im Rahmen von Folgeuntersuchungen wurden nach drei und sechs Monaten neue NPHV-Infektionen bei sieben Fohlen und zwei Stuten nachgewiesen. Drei der initial virämischen Stuten sowie das vertikal infizierte Fohlen waren während des gesamten Studienverlaufs von sechs Monaten persistent infiziert. Die Sequenzierung und phylogenetische Analyse der viralen RNA zeigte, dass NPHV-Varianten innerhalb der einzelnen Stuten-Fohlen-Herden zirkulierten. Diese Ergebnisse und die weite Verbreitung der NPHV-Infektionen lassen eine effektive horizontale Übertragung des Virus vermuten.

Da bei vier Fohlen sechs Monate nach der Geburt eine akute NPHV-Infektion festgestellt wurde, wurden diese Fohlen im Rahmen einer Folgestudie bis zum Alter von 12–13 Monaten weiter untersucht. Ein erster Hinweis auf einen potentiellen Ausscheidungsweg ist der Nachweis von NPHV-RNA in Nasentupfern bei drei der akut infizierten Fohlen. Keines der vier Fohlen war in der Lage, das Virus im untersuchten Zeitraum zu eliminieren, obwohl im Verlauf der Infektion anti-NPHV-NS3-Ak nachgewiesen werden konnten.

 

Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit erstmalig eine vertikale Transmission von NPHV nachgewiesen, wohingegen keine vertikale Infektion mit EPgV 1 und TDAV gezeigt werden konnte. Zudem wurden erste Hinweise auf einen horizontalen Übertragungsweg über direkten Kontakt gefunden. In zukünftigen Studien muss einerseits das Vorkommen und die Relevanz der vertikalen NPHV-Transmission mit größeren Fallzahlen bestätigt werden. Andererseits sind weitere Studien notwendig, um horizontale Übertragungswege, beispielsweise über den direkten Kontakt, zu untersuchen.

abstract (englisch)

In recent years several new equine viruses within the family Flaviviridae have been discovered. The nonprimate Hepacivirus (NPHV) and the Equine Pegivirus 1 (EPgV 1) are widely distributed viral infections among horses, whereas Theiler’s disease associated virus (TDAV) has been rarely detected. NPHV represents the phylogenetically closest known relative of hepatitis C virus (HCV) in humans. For NPHV a hepatotropism was ascertained and subclinical hepatitis has been diagnosed in some infected horses. However, pathogenesis and routes of transmission still remain elusive for the new viruses.

Within this work potential routes of transmission have been studied, with the focus on the vertical transmission from the mare to its foal. Therefore, twenty Thoroughbred broodmares and their foals were monitored during foaling season 2015 until six months post-partum. Serum from the mares was taken before parturition. During foaling umbilical cord blood, pre-suckling colostrum and placenta samples were collected. Postnatal serum was taken from the foal approximately 14 hours after delivery. Viral RNA was detected by quantitative real-time PCR and anti-NPHV NS3 antibodies (ab) by luciferase immunoprecipitation system. Additionally, EPgV 1 and TDAV RNA was detected via quantitative multiplex RT-PCR. To investigate the clinical relevance of the viral infections, liver specific parameters were measured and general examinations were performed.

All samples lacked the presence of TDAV RNA but four mares carried EPgV 1 RNA before parturition. However, none of their foals was postnatally EPgV 1 positive. Thus, a vertical transmission could not be investigated for TDAV and EPgV 1.

Therefore, vertical NPHV infection occurred in one mare-foal pair. In total 80 % of the mares were anti-NPHV NS3 abs positive, with four of them additionally carrying NPHV RNA. Only one foal of the four mares was NPHV RNA positive in its postnatal serum sample and it was the same mare-foal pair that exclusively had NPHV RNA in the umbilical cord blood sample. The umbilical cord blood as well as the postnatal serum samples of the other foals were NPHV RNA negative. The detection of viral RNA directly after foaling supports an intrauterine infection of the fetus. The NPHV RNA in the samples were sequenced in the predicted E1E2 region of the NPHV genome and phylogenetic analysis revealed identical NPHV variants in the postnatal serum of the foal and the umbilical cord blood. Because of slight differences compared to the NPHV variant in the maternal serum, a fetal bottleneck infection with few maternal quasispecies seems likely. However, vertical transmission and the occurrence of placentitits at parturition or during late gestation seem unrelated, because the placenta of the mare was macroscopical and pathohistological unremarkable.

The transfer of maternal anti-NPHV NS3 abs from the mare to its foal could be retraced via colostrum, because the umbilical cord blood of the seropositive mares was anti-NPHV NS3 ab negative but the post-suckling serum of their foal contained antibodies. New infections were detected in seven foals and two mares within the monitored six months after parturion. Three of the initially viremic mares and the vertically infected foal remained NPHV RNA positive for the studied six months. The identified NPHV isolates were sequenced and the circulation of certain isolates within the pasture herds was shown by phylogenetical analysis. Our results and the high prevalence of NPHV infection suggest an efficient horizontal transmission.

In four foals, an acute NPHV infection has been detected at the age of six months. Therefore, a follow-up study was conducted to monitor these foals until the age of 12 to 13 months. The nasal swabs of three acutely infected foals were NPHV RNA positive, representing a first evidence of a potential mode of virus excretion. All four foals remained viremic during the entire monitored time, although anti-NPHV NS3 abs were detected.

In summary, this is the first description of vertically acquired NPHV infection, whereas vertical transmission has not been observed for EPgV 1 and TDAV. Additionally, our results suggest a horizontal route of transmission via direct contact. Future studies with larger cohorts are needed to confirm the occurrence and the prevalence of vertical transmission of NPHV in horses. Furthermore, the horizontal mode of NPHV transmission via direct contact requires further investigation.

keywords

Nicht-primates Hepacivirus (NPHV); vertikale Transmission; Pferd; Nonprimate Hepacivirus (NPHV); vertical transmission; horse

kb

9.830