Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Maren Friebe

 

The isolated perfused equine distal limb and synoviocyte cultures as models for pharmacological studies

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-102940

title (ger.)

Das isoliert perfundierte Pferdebein und kultivierte Synoviozyten als Modelle für pharmakologische Studien

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/friebem_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden PhD-Arbeit war es, geeignete Modelle zur Untersuchung pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Daten von Substanzen zu etablieren, mit denen beim Pferd Gelenksbehandlungen durchgeführt werden.

Um zunächst die Verteilung von Stoffen nach intra-artikulärer oder systemischer Applikation zu untersuchen, wurde das ex vivo Modell des isoliert perfundierten distalen Pferdebeins etabliert. Vordergliedmaßen von Pferden wurden an einem Schlachthof im Karpalgelenk exartikuliert und innerhalb von 1 h nach der Schlachtung über die A. mediana mit oxygenierter Tyrodelösung, die Natrium-Carboxymethylcellulose enthielt, bei einer Flussrate von ca. 65 ml/min für 8 Stunden perfundiert. Die Gewebevitalität während der Perfusion wurde durch die Bestimmung von Glukoseverbrauch, Laktatproduktion und LDH-Freisetzung im venösen Perfusat der V. radialis überprüft. Des Weiteren wurden Hautoberflächentemperatur und Gewichtszunahme als Indikatoren für periphere Blutversorgung und Ödembildung kontrolliert. Die Unversehrtheit der Gelenkkapsel wurde mittels histologischer Untersuchung beurteilt. Mindestanforderungen für eine ausreichende Vitalität der distalen Gliedmaße wurden formuliert.

Die Abflutung von Betamethason über die V. radialis nach intra-artikulärer Injektion von BMdihydrogenphosphat-Dinatrium (4 mg BM) ins Fesselgelenk wurde mittels HPLC und UV-Detektion gemessen (n=6). Die durchschnittliche BM-Abflutung pro Minute betrug 5.1 µg/min, mit Werten zwischen 9 µg/min und 2.9 µg/min. 7.5 Stunden nach i.a.-Applikation waren 2.3 mg BM aus dem Gelenk abgeflutet.

Die Distribution von Acetylsalicylsäure und ihres Metaboliten Salicylsäure in das Fesselgelenk nach systemischer Applikation von ASA wurde ebenfalls am isoliert perfundierten Pferdebein untersucht (n=8). Plasmakonzentrationen von ASA und SA wurden aus einer entsprechenden in vivo Studie übernommen und dem Perfusat zugesetzt (BROOME et al. 2003). Ihre Konzentrationen in der Synovialflüssigkeit wurden mit einer kalibrierten Mikrodialysesonde und HPLC-UV bestimmt. Zwei Beine wurden mit verdünntem autologem Blut perfundiert, um eine Orientierung hinsichtlich des Einflusses der Plasmaproteinbindung zu erhalten. In den Tyrode-perfundierten Gliedmaßen (n=6) wurden maximale synoviale Konzentrationen von 2.1x10-5 mol/l (ASA) und 1.27x10-4 mol/l (SA) erreicht. Die Salicylatkonzentration in der Synovialflüssigkeit der hämoperfundierten Beine war ca. 50 % niedriger, wahrscheinlich aufgrund der Plasmaproteinbindung der Salicylate von 50 %. Die Abnahme von ASA und SA in der Synovia verlief bedeutend langsamer als im Plasma, was für eine Akkumulation im Gelenk spricht.

Um im Anschluss die antiphlogistische Wirkung der im isoliert perfundierten Pferdebein gemessenen Synovialkonzentrationen einzuordnen, wurde ein primäres Zellkulturmodell aus equinen Synoviozyten etabliert. Die aus makroskopisch gesunden Fesselgelenken (n=6) isolierten Zellen wurden mit LPS stimuliert und mit abnehmenden Konzentrationen von BM, ASA und SA behandelt. Die Inhibition der Prostaglandin E2-Produktion im Vergleich mit einer unbehandelten Kontrolle wurde als Indikator für einen entzündungshemmenden Effekt verwendet. Die niedrigsten Konzentrationen, die zu einer signifikanten Hemmung der PGE2-Produktion führten, betrugen 2.55x10-9 mol/l für BM und 7.77x10-6 mol/l für ASA. Die eingesetzten SA-Konzentrationen führten nicht zu einer signifikanten PGE2-Hemmung. Die Ergebnisse bedeuten einen Hinweis darauf, dass die entzündungshemmende Wirkung im Gelenk im Vergleich zum Plasma länger andauert.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das isoliert perfundierte Pferdebein und die Synoviozytenkultur erfolgreich etabliert werden konnten. Ohne dass Versuchspferde eingesetzt werden, ermöglichen sie die Untersuchung pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Charakteristika von Substanzen,  die für die Gelenksbehandlung beim Pferd eingesetzt werden.

 

abstract (englisch)

It was the aim of this PhD-project to establish suitable models for investigating pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of substances administered to the equine joint.

Firstly, in order to assess the distribution of drugs either after intra-articular or systemic application, the ex vivo model of the isolated perfused equine distal limb was established. Distal forelimbs of horses obtained from a slaughterhouse were exarticulated in the carpal joint. Within 1 h after slaughter, the median artery was canulated and extremities were perfused with oxygenated tyrode solution containing sodium carboxymethyl cellulose at a flow rate of approx. 65 mL/min for up to 8 h. Tissue viability during the perfusion period was verified by determination of glucose consumption, lactate production and LDH liberation in the venous perfusate sampled from the radial vein. Furthermore, skin surface temperature and weight increase were monitored as indicators of peripheral blood supply and edema formation. The integrity of the joint capsule was assessed by histologic examination. Minimum requirements for parameters were formulated to ensure sufficient viability of the distal limb.

The articular efflux rate of BM in the venous perfusate of the radial vein after intra-articular injection of BM disodium phosphate (4 mg BM) into the fetlock joint was measured with HPLC and UV detection (n=6). The average BM efflux rate per minute was calculated to be 5.1 µg/min with values ranging from 9 µg/min to 2.9 µg/min. 7.5 h after i.a.-application, 2.3 mg BM had left the joint.

Also, the distribution of ASA and its metabolite SA into the fetlock joint after systemic administration of ASA was determined in the isolated perfused equine distal limb (n=8). Plasma concentrations of ASA and SA were adapted from an in vivo study and added to the perfusate (BROOME et al. 2003).  ASA and SA concentrations in the synovial fluid were determined using calibrated microdialysis probes and HPLC-UV. Two distal limbs were perfused with diluted autologous blood in order to give some orientation concerning the influence of plasma protein binding on the synovial distribution. For the tyrode-perfused limbs (n=6), ASA concentrations in the synovial fluid reached a maximum of 2.1x10-5 mol/L, maximum SA concentrations were 1.27x10-4 mol/L. Synovial salicylate concentrations in the hemoperfused limbs were about 50 % lower, presumably owing to the salicylate plasma protein binding of 50 %. The decrease of ASA and SA in synovial fluid did not parallel the decrease in plasma concentrations, indicating an accumulation in the joint.

Secondly, in order to assess the anti-inflammatory potency of concentrations measured in the isolated perfused equine distal limb, a cell culture model of primary equine synoviocytes was established. Cells isolated from macroscopically healthy fetlock joints (n=6) were stimulated with LPS and treated with decreasing doses of BM, ASA and SA. The inhibition of prostaglandin E2 production in comparison with an untreated control was determined as an indicator of an anti-inflammatory effect.

The lowest concentrations causing a significant inhibition of PGE2 production were 2.55x10-9 mol/L and 7.77x10-6 mol/L for BM and ASA, respectively. SA concentrations employed did not cause a significant PGE2 inhibition. These results may be a hint for a prolonged anti-inflammatory effect in the joint in comparison with plasma concentrations.

In summary, the isolated perfused equine distal limb and primary equine synoviocyte cultures were successfully established as useful tools for the investigation of pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of substances administered to the equine joint without the necessity to use living horses.

 

keywords

Pferd, Distale Gliedmaße, EX vivo Modell, horse, distal limb, ex vivo model

kb

1.811