Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Tanja Fleischer

Validierung eines ELISAs zur Unterscheidung von Infektionsantikörpern und Impfantikörpern gegen Mycoplasma hyopneumoniae beim Schwein

 

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104681

title (engl.)

Validation of an ELISA for the differentiation between antibodies induced by infection and antibodies from vaccination against Mycoplasma hyopneumoniae of pigs

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/fleischert_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Die Enzootische Pneumonie ist noch immer eine sehr bedeutende respiratorische Erkrankung beim Schwein. Mit der Impfung gegen Mycoplasma (M.) hyopneumoniae können die wirtschaftlichen Schäden, verursacht durch verringerte Tageszunahmen, verlängerte Mastzeit und erhöhten Antibiotikaverbrauch, weitestgehend verhindert werden. Eine Unterscheidung von Impfantikörpern und Antikörpern, die durch eine Feldinfektion hervorgerufen wurden, ist durch die derzeit erhältlichen ELISAs nicht möglich. Wünschenswert wäre es jedoch, einerseits eine durchgeführte Impfung serologisch sicher bestätigen zu können, andererseits nachzuweisen, ob sich ein geimpftes Schwein mit M. hyopneumoniae infiziert hat. In dieser Arbeit wurde dazu ein neuer ELISA (Mhp366 ELISA, entwickelt von MEENS et al. (2010)) evaluiert, der ausschließlich Antikörper nach einer M.-hyopneumoniae-Infektion detektieren soll, nicht aber Impfantikörper. Der Mhp366 ELISA wurde auf seine diagnostischen Fähigkeiten geprüft und seine praktische Anwendbarkeit im Feld beurteilt.

In einem Impfversuch wurde zunächst bei drei M.-hyopneumoniae-Vakzinen überprüft, ob sich mit einem in der Praxis üblichen ELISA (HerdChek® Mhyo Antibody Test Kit, Idexx Laboratories, Westbrook, Maine) detektierbare Serumantikörper entwickeln. Dies konnte für die Vakzinen Stellamune® Mycoplasma (Fa. Elanco Animal Health, Bad Homburg) und M+PAC® (Fa. Intervet, Unterschleißheim) bestätigt werden, nicht aber für Ingelvac MycoFLEX (Fa. Boehringer, Ingelheim). Darüber hinaus konnte belegt werden, dass der Mhp366 ELISA bei Anwesenheit von Impfantikörpern im Vergleich zum herkömmlichen ELISA nicht reagiert. Somit kann für 2 der 3 getesteten Vakzinen mit vergleichender Serologie (IDEXX-ELISA positiv/Mp366 ELISA negativ) eine Aussage getroffen werden, ob eine Impfung durchgeführt wurde. Fallen beide Tests positiv aus, kann keine Aussage zur Impfung gemacht werden, da eine Feldinfektion anzunehmen ist.

Anhand von 100 Serumproben und 100 Lungenproben aus 15 verschiedenen Betrieben, die von Schweinen stammten, die mittels PCR und Immunhistologie als M.-hyopneumoniae-positiv (n=53) oder negativ (n=47) unterteilt werden konnten, wurde der Cut-off für den Mhp366 ELISA auf 0,6 EU% festgelegt mit einem Intermediärbereich von 0,4 bis 0,6 EU%. Daraus ergaben sich eine Spezifität von 100 % und eine Sensitivität von 15 %. Mit derselben Methode wurden die Gütekriterien des IDEXX-ELISA überprüft mit dem Resultat, dass die Spezifität einen Wert von 72 % und die Sensitivität einen Wert von 57 % erreichte, was deutlich unter den Angaben in der Literatur liegt.

Zuletzt wurden 629 Feldproben aus 37 Betrieben mittels des Mhp366 ELISA untersucht und die Ergebnisse mit denen des IDEXX-ELISAs verglichen sowie ihre Aussagekraft bezüglich des Infektionsstatus auf Betriebsebene bewertet. Es zeigte sich, dass der Mhp366 ELISA als alleiniges diagnostisches Mittel nicht einsetzbar ist da bei einer Sensitivität von 15 % und zu geringen Probenzahlen falsch negative Ergebnisse auftreten können. In Kombination mit dem IDEXX-ELISA kann er aber die Beurteilung in manchen Betrieben erheblich verbessern, da durch seine hohe Spezifität wenige positive Ergebnisse ausreichen, um eine Aussage des IDEXX-ELISA auf Bestandsebene zu bestätigen oder in Frage zu stellen. Die Übereinstimmung der beiden ELISAs lag bei nur 50 %, was durch die unterschiedliche Reaktion auf Impfantikörper erklärt werden kann.

Abschließend muss gesagt werden, dass die Sensitivität durch Weiterentwicklung des Mhp366 ELISAs noch verbessert werden muss, um eine hohe Praxisrelevanz zu gewährleisten.

abstract (englisch)

Today, Enzootic Pneumonia of pigs is still a very significant respiratory disease. Vaccination against Mycoplasma (M.) hyopneumoniae can help to prevent the economic losses due to reduced daily weight gain, an extended fattening period and an increased need for antibiotics. At present, no ELISA is able to distinguish between antibodies induced by infection or vaccination respectively. On the one hand it would be desirable to reliably verify a vaccination and on the other hand to prove an infection of a vaccinated animal. In this study, a new ELISA (Mhp366 ELISA, developed by MEENS et al. (2010)) was evaluated, which should have the ability to only react to antibodies in response to an infection but not to immunization. Its diagnostic ability and practicability using field samples were tested.

In a trial with three M. hyopneumoniae vaccines, it was tested if a seroconversion was detectable by a commonly used ELISA (HerdCheck® Mhyo Antibody Test Kit, Idexx Laboratories, Westbrook, Maine). This was confirmed for the vaccines Stellamune® Mycoplasma (Elanco Animal Health, Bad Homburg) and M+PAC®, (Intervet, Unterschleißheim). For Ingelvac MycoFLEX® (Boehringer, Ingelheim) no detectable seroconversion was found four weeks after vaccination. Furthermore, it was verified that the Mhp366 ELISA does not react in the presence of antibodies due to vaccination, in contrast to the commonly used ELISA. For this reason it can be stated that for 2 out of 3 tested vaccines it is possible to determine the vaccination status by comparing the serologic test results (IDEXX-ELISA positive/Mhp366 ELISA negative). In case both tests are positive, it has to be assumed that a field infection occurred and no statement can be made about the vaccination status.

To determine a cut off for the Mhp366 ELISA, 100 serum samples originated from pigs from 15 different farms were subdivided by PCR and immunohistochemistry assay into M. hyopneumoniae positive (n=53) and negative (n=47) samples. Using these samples the cut off was set at 0,6 EU%; values between 0,4 and 0,6 EU% were considered doubtful. In response, the test has a specificity of 100% and a sensitivity of 15%. With the same method, the performance criteria for the IDEXX-ELISA were determined. As a result, the specificity and the sensitivity reached values of 72% and 57%, respectively, which is far below the data of the available literature. The specifity could be influenced by antibodies due to vaccinations.

Lastly, 629 field serum samples from 37 different farms were tested with the Mhp366 ELISA and subsequently compared with the results of the IDEXX-ELISA. Their predictive value was evaluated with regard to the infection status at herd level.

As a result of this examination, the Mhp366 ELISA cannot be used as a sole diagnostic method to detect M. hyopneumoniae infections. Its low sensitivity of 15 % and insufficient numbers of samples could create false negative results. However, in combination with the IDEXX-ELISA the assessment can be improved significantly in some herds. Because of its high specificity just a few positive samples are needed to confirm or to question the results of the IDEXX-ELISA at herd level. The coincidence rate of only 50 %between both ELISAs was estimated, which can be explained by the different reactions to antibodies induced by vaccination.

In conclusion, the sensitivity still has to be improved, by further developments of the Mhp366 ELISA, in order to guarantee a high degree of practical relevance.

keywords

Mycoplasma hyopneumoniae, ELISA, Mhp366, Mycoplasma hyopneumoniae, ELISA, Mhp366 

kb

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