Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Samuel Fischer

Untersuchungen zur Reduktion von Campylobacter beim Broiler durch den Einsatz von Bakteriophagen unter Berücksichtigung von Resistenzentwicklungen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103826

title (engl.)

Investigations on reduction of Campylobacter in broilers using bacteriophages under consideration of bacterial resistance

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/fischers_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Aufgrund der anhaltend hohen Infektionsrate des Menschen mit Campylobacter besteht die Notwendigkeit, geeignete Maßnahmen zu deren Minimierung zu entwickeln. Die Anwendung von Phagen auf Herdenebene wurde bereits als eine mögliche Maßnahme beschrieben. Der Einfluss der bakteriellen Resistenzen auf die langfristige Wirksamkeit der zur Therapie ausgewählten Phagen wird dabei kontrovers diskutiert.

Um die Resistenzlage einer Bakterienpopulation schnell und kostengünstig einschätzen zu können, wurde in einem ersten Schritt der bisher angewendete konventionelle Test vereinfacht, indem die Methode erfolgreich an das Mikrotiter­platten-Format adaptiert wurde. Dabei wurden die Mengenverhältnisse von Campylobacter, Phagen und Nährmedium konstant gehalten. Im konventionellen Verfahren konnte die exakte „Efficiency of Plating“ (EOP), das Verhältnis gebildeter Plaques zu den zugegebenen Phagen ermittelt werden, im neu entwickelten Test beschränkt sich die Auswertung auf die zwei Kategorien „empfänglich wie das Ausgangsisolat“ und „weniger empfänglich als das Ausgangsisolat bis resistent“. Der entwickelte Test bringt eine deutliche Verringerung des Arbeitsaufwandes, ermöglicht einen hohen Probendurchsatz und birgt weiterhin die Möglichkeit einer möglichen Teilautomatisierung des Untersuchungsprozesses. Die damit erzielbare zusätzliche Verringerung des Arbeitsaufwandes könnte in Zukunft die Überwachung der Wirksamkeit von Phagen-Präparaten im Feld mit einem hohen Durchsatz von Campylobacter-Isolaten kostengünstig ermöglichen.

Im zweiten Schritt wurde die Fähigkeit von in-vitro wirksamen Phagen Campylobacter im Broiler zu reduzieren im Tiermodell überprüft. Dafür wurde sowohl ein Phagen-Cocktail aus vier Phagen als auch ein Einzel-Phage aus diesem Cocktail an experimentell mit Campylobacter infizierte Broiler verabreicht. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Resistenzentwicklung von Campylobacter gegen die einzelnen Phagen und gegen den Phagen-Cocktail gelegt.

In diesen Untersuchungen waren die eingesetzten Phagen in der Lage, sich im Blinddarm der Tiere über einen Zeitraum von mindestens 42 Tagen zu halten und zu vermehren. Die Konzentrationen im Blinddarminhalt schwankten zu Beginn zwischen log10 2,7 PBE/g und log10 6,1 PBE/g und stabilisierten sich bei log10 4 PBE/g. Bei einzelnen Tieren, insbesondere in der Gruppe, die nur einen Phagen erhielt, konnten jedoch keine Phagen nachgewiesen werden.

Bezüglich der in-vivo-Wirksamkeit gegen Campylobacter lassen sich die Ergebnisse dahingehend zusammenfassen, dass die in-vitro wirksamen Phagen, sowohl als Cocktail- als auch als Einzel-Phagen-Applikation, in der Lage waren, den Gehalt an Campylobacter im Blinddarm von Broilern um bis zu log10 2,8 KBE/g zu reduzieren. Dabei war die vier Wochen dauernde signifikante Reduktion von einer zu Beginn und gegen Ende des Untersuchungszeitraumes eher geringen Reduktion eingerahmt. Mithilfe des hier eingesetzten Cocktails konnte keine höhere Reduktion erzielt werden, als mithilfe eines einzelnen Phagen aus dem Cocktail.

Bezüglich der Resistenzentwicklung lässt sich zusammenfassend sagen, dass gegen jeden Phagen Resistenzen ausgeprägt wurden. Allerdings war ein Phage stärker von der Resistenzbildung durch den verwendeten Campylobacter-Stamm betroffen als die übrigen drei Phagen. Die Resistenzen gegen den Cocktail waren grundsätzlich am geringsten ausgeprägt. Es ließ sich erstmalig zeigen, dass der Anteil der Resistenzen-tragenden Campylobacter-Teilpopulation innerhalb der ersten zwei Wochen nach der Behandlung mit Phagen erst zu- und anschließend wieder abnimmt, um sich schließlich auf einem niedrigen Niveau von weniger als 10% zu stabilisieren. Dabei zögerte der Phagen-Cocktail im Vergleich zum Einzel-Phagen die Resistenzbildung zeitlich heraus und milderte das Ausmaß ab. Differenzen innerhalb der bisher in der Literatur beschriebenen Resistenzraten und den eigenen Untersuchungen lassen sich damit in erster Linie durch unterschiedliche Untersuchungszeitpunkte und –intervalle erklären.

Die Resistenzbildung führte nach der Einzel-Phagen-Applikation zu einem kurzzeitigen Anstieg von Campylobacter, nach Gabe des Phagen-Cocktails ließ sich die verringerte Campylobacter-Reduktion errechnen. Da ein Vergleich zwischen einer Cocktail- und Einzel-Phagen-Applikation bisher nicht beschrieben worden ist, ließ sich damit erstmalig feststellen, dass die Verabreichung eines Phagen-Cocktails im Vergleich zur Verabreichung eines Einzel-Phagen zu einer höheren Behandlungs­sicherheit und in den ersten Tagen nach der Behandlung aufgrund verzögerter Resistenzbildung zu einer stabileren Reduktion von Campylobacter führen kann, was einem Einsatz der Phagen kurz von der Schlachtung entgegenkommt. Insgesamt hatte der Cocktail somit einen positiven Einfluss auf die Eindämmung der Auswirkungen der Resistenzbildung. Die Resistenzrate war insgesamt gegen den Gesamt-Cocktail (9%) geringer, als die Resistenzrate gegen den Einzel-Phagen (16%). Grundsätzlich war die resistente Campylobacter-Population nicht in der Lage, das Kolonisationsniveau der unbehandelten Kontrolltiere zu erreichen.

Phagen sind grundsätzlich geeignet die Campylobacter-Last auf Herdenebene zu senken. Die Höhe der im Einzelfall erzielbaren Reduktion hängt dabei von einem Zusammenspiel vieler Faktoren wie Verabreichungsweg, -matrix, -dauer, -zeitpunkt,  -dosis, Anzahl der eingesetzten Phagen-Stämme, Anteil der resistenten Bakterienpopulation, den eingesetzten Bakterien- und Phagen-Stämmen usw. ab.

Die mithilfe von Phagen erzielbaren Reduktionen um im Schnitt zwei Log-Stufen können laut einer Risikoanalyse zu einer 30fachen Reduktion der Übertragung von Campylobacter vom Geflügel auf den Menschen führen und somit einen wichtigen Beitrag für die Gesunderhaltung der Bevölkerung leisten.

abstract (englisch)

Considering the persistent high infection rate of humans with Campylobacter, there is a need to develop appropriate minimizing strategies for Campylobacter on retail products along the food chain. The application of phages at flock level has been described as a possible measure. The influence of bacterial resistance on the long lasting efficiency is a matter of debate.

In a first step, the so far used conventional test for the investigation of phage resistance of a bacterial strain has been adopted to a microtitre plate in order to allow a fast and cost-effective estimation for the current resistance situation of a bacterial population. The conventional test describes for a population of Campylobacter i) the rate of resistant isolates (0 plaques) and ii) the degree of susceptibility as relation of generated plaques to applied PFU, also called relative efficiency of plating (EOP), for the remaining isolates. The new test divides the bacterial isolates only into two categories: i) isolates which are as susceptible as the original strain and ii) less susceptible or resistant isolates.

The new susceptibility test reduces the workload, makes a high sample throughput easy and allows further automatisation of the investigation process. The attainable simplification would later contribute to a cost-effective monitoring of the efficiency of therapy-phages in the field.

In a second step, the ability of in-vitro effective phages was tested, considering their potential to reduce the Campylobacter-load in broilers. Therefore, a phage cocktail, containing four phages, and a single phage of this cocktail were administered to experimentally Campylobacter-infected broilers. Particular attention was paid to the emergence of resistance of Campylobacter to the single phages and to the phage-cocktail.

In these examinations the applied phages were able to survive and to multiply in the ceca of Campylobacter-positive broilers over a time-span of at least 42 days. The phage concentrations, measured in the ceca, ranged from log10 2.7 PFU/g to log10 6.1 PFU/g in the beginning and stabilized at log10 4 PFU/g. From some phage-treated birds, especially from the group which received only phage, no phages were recovered.

Concerning the in-vivo efficiency of the phages against Campylobacter, the results can be summarized as follows: the in-vitro efficient phages were able to reduce the Campylobacter-load in the ceca of chickens by up to log10 2.8 CFU/g after single-phage application as well as after phage-cocktail application. A four week lasting period of significant Campylobacter-reduction was framed by only low reduction levels in the beginning and at the end of the investigation period. The cocktail was not able to reduce the Campylobacter-load in higher amount compared to the single phage.

Campylobacter developed phage-resistance to each phage. One phage was more affected than the other three phages. The resistance-level for the cocktail was generally below the resistance-level for the single phages. For the first time, it has been shown that the proportion of the resistance-carrying Campylobacter-population arised and increased during the first two weeks after phage application, subsequently decreased and finally stabilized at a low level of less than 10%. Thereby, the phage-cocktail delayed and moderated the upcoming resistance. Therefore, differences between resistance rates described in other studies are possibly explainable by different time points of the investigations.

The upcoming resistance caused a short increase of the Campylobacter-load in the single-phage treated group, in the cocktail treated birds the reduced Campylobacter-reduction was ascertainable. Compared to the single-phage application, the use of the phage-cocktail led to a higher treatment safety and to a more stable reduction of Campylobacter in the first days after phage-application due to the delayed increase of a resistant Campylobacter-population. Therefore, the use of a cocktail could enhance the efficiency of phages applied short time before slaughter. The resistance rate for the cocktail in the cocktail treated group (9%) was lower compared to the rate for the single phage in the single phage treated group (16%). The resistant Campylobacter-population was not able to achieve the Campylobacter colonization level of the phage free control birds.

In principle, phages are able to reduce the Campylobacter-load at flock-level. The amount of the achievable reduction depends on the interaction of various factors, such as route, time, dose of administration as well as number of phage strains, amount of the resistant bacterial population and the phage and Campylobacter strains, etc.

The mean reductions of log10 2 CFU/g intestinal content achievable by the use of phages could lead to a 30-fold decline in human campylobacteriosis caused by chicken meals and therefore contribute sustainably to human health.

keywords

Campylobacter, Bakteriophagen, Broiler; Campylobacter, bacteriopages, broiler

kb

1.323