Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Teresa Maria Fischbach

Ko-Kultur primärer boviner Hepatozyten und Makrophagen: Einfluss auf Zellfunktionalität und -viabilität

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-111213

title (eng.)

Co-culture of primary bovine hepatocytes and macrophages: influence on cell functionality and viability

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2018

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/fischbacht_ss18.pdf

abstract (deutsch)

Mit dem Ziel, die Funktion und die Einflussfaktoren auf die GHR-Expression und IGF-Produktion in der Leber zu untersuchen, wurde in den vergangenen Jahren ein Isolations- und Kultivierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten etabliert (Ehrhardt und Schmicke 2016, Witte et al. 2017). Da bei der bovinen Hepatozytenmonokultur bisher die Bedeutung der immunregulatorischen Makrophagen gänzlich außer Acht gelassen wurde, war eines der Ziele dieser Arbeit die Etablierung der Isolation von Kupfferzellen aus der bovinen Leber und Ko-Kultivierung mit primären Hepatozyten. Da Dexamethason in Hepatozytenkulturen die GHR mRNA-Expression inhibiert (Beauloye et al. 1999; Godoy et al. 2010), sollten des Weiteren alternative Entzündungshemmer auf ihre Effizienz in der Ko-Kultur untersucht werden. Die Beurteilung erfolgte dabei über die Erfassung von Markern für Stoffwechselfunktionen, Entzündungsreaktionen und Dedifferenzierung der Hepatozyten, sowie über die Messung der GHR1A-Expression als endokrinologischer Marker.

Die Leberzellisolation erfolgte aus dem Lobus caudatus von in der Klinik für Rinder aufgrund infauster Prognose euthanasierter Rinder. Mittels einer Two-step-Kollagenaseperfusion nach Seglen (1976) wurden die Leberzellen aus ihrem Zellverband gelöst und lagen anschließend als Zellsuspension vor. Die weitere Aufreinigung der Hepatozyten erfolgte über einen 25%-igen Percoll-Gradienten. Die Kupfferzellen wurden durch eine Zweidichtegradientenzentrifugation (25/50%-iges Percoll) mit anschließender selektiver Adhäsion auf unbehandelten Plastikkulturschalen isoliert. Der Einfluss der Kupfferzellen auf die primären bovinen Hepatozyten in Ko-Kultur wurde im Hauptversuch in zwei verschiedenen Ko-Kulturmodellen untersucht. In einer Kulturform standen die Kupfferzellen in direktem Kontakt zu den Hepatozyten (HKCd), in der zweiten lagen sie durch die zweite Kollagenschicht räumlich getrennt und damit in indirekten Kontakt zu den Hepatozyten vor (HKCid). Als Kontrolle diente ein drittes Modell, bestehend aus einer Hepatozytenmonokultur (HMC). Die Zellen wurden 7 Tage lang kultiviert. Anhand von Laboranalysen der Vitalitätsparameter Albumin und Harnstoff konnte gezeigt werden, dass HKCid, nicht aber HKCd, der Hepatozytenmonokultur hinsichtlich der Funktionalität der Zellen überlegen ist. Die GHR1A mRNA-Expression wurde in Gegenwart von Kupfferzellen in beiden Ko-Kulturen deutlich inhibiert. Mithilfe fluoreszenzmarkierter Latex beads konnten in der Hepatozyten-Mono-Kultur 17,5% Kupfferzellen nachgewiesen werden. Der Vergleich der Ko-Kulturen HKCd und HKCid mit der ebenfalls Kupfferzellen enthaltenden HMC zeigte, dass die Anzahl der in Kultur enthaltenen Kupfferzellen einen Effekt auf die GHR1A mRNA-Expression hat. Die Stoffwechselfunktion und der Erhalt der Differenzierung der Hepatozyten wurden dagegen maßgeblich durch den Abstand der Kupfferzellen zu den Hepatozyten beeinflusst. Da Dexamethason in Hepatozytenzellkulturen die Expression von GHR1A signifikant supprimiert (Witte et al. 2018), sollten des Weiteren alternative Entzündungshemmer auf ihre Effizienz hinsichtlich der Unterdrückung inflammatorischer Reaktionen und der Dedifferenzierung in HMC und HKCid untersucht werden. Aus diesem Grund wurde in einem weiteren Versuch vergleichend DHEA in einer physiologischen Konzentration, DHEA in einer pharmakologischen Konzentration, Aspirin, DHEA in einer pharmakologischen Konzentration zusammen mit Aspirin, Hydrocortison und Dexamethason an Hepatozytenmonokulturen und Hepatozyten-Kupfferzell-Ko-Kulturen in direktem Kontakt (HKC) angewendet. Anhand der Laboranalysen der Genexpressionen von NFκB-α-Inhibitor, Vimentin und GHR konnte gezeigt werden, dass weder DHEA noch Aspirin einen Einfluss auf die Wachstumshormonrezeptorexpression haben. Ein signifikanter Einfluss auf die inflammatorische Reaktion der Zellen konnte bei keinem der alternativen Entzündungshemmer nachgewiesen werden. Auch der Dedifferenzierung der Hepatozyten wurde unter dem Einfluss von Aspirin und DHEA nicht entgegengewirkt, im Falle von DHEA wurde diese sogar gefördert. Damit stellen die erprobten Entzündungshemmer keine Alternative für Dexamethason im Einsatz in der Hepatozyten-Zellkultur dar.

Zusammenfassend kann in zukünftigen Studien durch die Ko-Kultivierung von Hepatozyten mit Kupfferzellen im indirekten Kontakt positiv auf die Stoffwechselfunktion und Dedifferenzierung der Hepatozyten eingewirkt werden. Sollte es Ziel sein, die GHR Funktionalität zu untersuchen, sollten allerdings keine beziehungsweise je nach Fragestellung eine kontrollierte Anzahl von Kupfferzellen in der Hepatozytenzellkultur vorhanden sein. Um dies zu erreichen, sollte das Protokoll der Hepatozytenaufreinigung abgeändert werden, um die Kontamination mit Kupfferzellen in der HMC so gering wie möglich zu halten. Durch keinen der verwendeten Entzündungshemmer konnten signifikante Effekte auf die inflammatorische Reaktion und Dedifferenzierung der Hepatozyten im Vergleich zu unbehandelten Zellen beaobachtet werden. Dieses Ergebnis legt nahe, dass in Zukunft auch Kurzzeitversuche an bovinen Hepatozyten ohne Zugabe eines Entzündungshemmers möglich sind.

abstract (englisch)

In order to examine factors influencing GHR expression and IGF production in liver in vivo in catlle, a protocoll for isolating and cultivating primary bovine hepatocytes was previously established (Ehrhardt and Schmicke 2016; Witte et al. 2018)). However, the influence of immunoregulatory macrophages on hepatocyte function was not addressed in former studies.  Therefore, the aim of this study was to establish a Kupffer cell isolation from bovine liver and the cocultivation of these cells together with primary hepatocytes. Since dexamethasone inhibits the GHR mRNA expression in hepatocyte cultures (Beauloye et al 1999, Godoy et al., 2010, Witte et al. 2018), alternative anti-inflammatory additives should be tested regarding their efficiency in coculture. The influecene of the Kupffer cells as well as the anti-inflammatory supplements was tested by detecting the metabolic function, the measurement of inflammation parameters and the dedifferentation of the hepatocytes as well as the expression of metabolism GHR as an endocrinologic marker.

Liver cells were gained from the Lobus caudatus of cows of the clinic for cattle euthanized due to illness and infaust prognosis. With a two-step collagenase perfusion according to Seglen (1976), the hepatocytes were isolated. The purification of hepatocytes out of the cell suspension was done using a 25% Percoll desitygradient centrifugation procedure. The Kupffer cells were isolated by using a two-layer densitiygradient centrifugation (25/50% Percoll) followed by selective adhesion of the cells to untreated plastic culture dishes. The influence of Kupffer cells on the primary bovine hepatocytes in cocultures was tested in two different coculture models. In the first coculture model the Kupffer cells were in direct contact to the hepatocytes (HKCd), in the second model Kupffer cells were in indirect contact to the hepatocytes seperated by a second collagen layer (HKCid). A hepatocyte monoculture (HMC) served as a control. The cultures were maintained for 7 days. On the basis of lab analysis of the metabolic parameters like albumin mRNA-expression it was demonstrated, that HKCid, but not HKCd is superior to hepatocyte monoculture regarding hepatocyte metabolic funtion. GHR1A mRNA-expression was inhibited in the presence of Kupffer cells in both cocultures models. By the use of fluorescence-labeled latex beads a contamination of 17,5% Kupffer cells in the hepatocyte monoculture could be detected. The comparison of the different cocultures with the hepatocyte monoculture, which also contains kupffer cells, showed a distinct effect of the amount of Kupffer cells in culture on the GHR1A mRNA-expression of the hepatocytes. The metabolic function and the dedifferentation of the hepatocytes in contrast were influenced by the gab between Kupffer cells and hepatocytes. Since dexamethasone significantly suppresses the expression of GHR1A in hepatocyte cell cultures (Witte et al. 2018), alternative anti-inflammatory supplemets to the cell culture medium should be examined with regard to their efficiency minimizing the inflammatory reaction, suppressing hepatocyte dedifferentiation, and maintainance of GHR expression in HMC and HKCid. For this purpose DHEA in a pharmacological and physiological concentration, aspirin, DHEA in a pharmacological concentration in combination with aspirin, hydrocortisone and dexamethasone were applied in hepatocyte monocultures and HKCd. It could be demonstrated that NFκB-α inhibitor, vimentin and GHR mRNA-expression was neither affected by DHEA in physiologically and pharmalogical concentrations nor by aspirin. In none of the tested anti-inflammatory agents a distinct impact on inflammatory response could be measured. Also, the dedifferentiation of hepatocytes was not influenced by DHEA and aspirin. Actually, DHEA increased dedifferentation indicated by increased vimentin mRNA-expression. In summary, none of the investigated anti-inflammatory supplements seems to be an alternative to dexamethasone for bovine hepatocyte cell culture.

In conclusion, the co-cultivation of hepatocytes with Kupffer cells in indirect contact in future studies can influence the metabolic function and dedifferentiation of the hepatocytes. Wheras in studies, which have the GHR1A mRNA expression as its foundation, no Kupffer cells or rather depending on the issue of the studie a controlled number of Kupffer cells should be present in the hepatocyte cell culture. In oder to archive this goal the protocol of hepatocyte purification should be modified to minimize the contamination with Kupffer cells in HMC. None of the anti-inflammatory agents could significantly limit the inflammatory response and dedifferentiation of the hepatocytes compared to untreated cells. This result demonstrates that in future studies short-term tests are possible, also without anti-inflammatory agents.

keywords

Kupfferzellen, Kokultur, Zelleinheits ; Kupffer cells, coculture, cell purity

kb

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