Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Carina Eydt

 

Equine multipotente, mesenchymale

Stromazellen (MSCs): Optimierung der Gewinnung,

Expansion und Kultivierung

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108950

title (engl.)

Equine multipotent, mesenchymal stromal cells (MSCs): optimization of extraction, expansion and cultivation

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/eydtc_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Equines Knochenmark wird seit geraumer Zeit nicht nur zur Prognostik und Diagnostik verwendet, sondern auch um daraus multipotente mesenchymale Stromazellen (MSCs) zu isolieren. Diese Zellen werden u.a. zur Behandlung von orthopädischen Erkrankungen des Pferdes eingesetzt. Aktuelle Studien zeigen, dass intraläsional applizierte MSCs den Heilungserfolg bei Sehnenschäden zu steigern vermögen. MSCs können durch ihre Fähigkeit der Selbsterneuerung und Reparation von Geweben die Entstehung von Rezidiven verringern. Mehrere Untersuchungen bestätigen, dass die Rezidivrate gesenkt und die Zeit der Rekonvaleszenz der behandelten Pferde beschleunigt werden kann. Zur MSC-basierten Behandlung werden zwischen 1x106 und 1x107 MSCs/ml in verletzte Strukturen injiziert. Entsprechende Anzahlen an MSCs müssen in möglichst kurzer Zeit aus dem equinen, sternalen Knochenmark isoliert und in vitro kultiviert werden. Die Gewinnung von Knochenmark aus dem equinen Sternum wird zwar häufig praktiziert, gilt aber aufgrund transsternaler Fehlpunktionen als risikobehaftet. Zurückführen lässt sich dies unter anderem auf widersprüchliche Abgaben in Bezug auf das Brustbein des Pferdes in der veterinäranatomischen Literatur. So ist der grundlegende Aufbau in Prae-, Meso- und Xyphosternum zwar sehr einheitlich beschrieben, aber die Struktur und Anzahl der Sternebrae, wird sehr heterogen angegeben. Um Klarheit zu erlangen, wurden Pferdebrustbeine zunächst isoliert und anschließend wurde mittels Computertomographie detailgenaue 3D-Modelle erstellt. Dabei zeigte sich, dass das Sternum aus sieben einander sehr ähnlichen, knöchernen Strukturen (Sternebrae) besteht. Durch eine Aufzählung dieser Strukturen von 1 bis 7 kann die Nomenklatur vereinheitlicht werden und so zu einer unzweideutigen Benennung der zur Knochenmarkaspiration empfohlenen Sternebrae beitragen.

Ebenso wie in Bezug auf die Nomenklatur des Sternums, existieren auch verschiedene Angaben bezüglich der Technik und der Tiefe der Knochenmarkentnahme. Die zu punktierenden Sternebrae werden laut aktueller Literatur mit sehr unterschiedlichen Angaben (Palpation verschiedener Bereiche des Sternums oder durch Ultrasonographie) aufgesucht. Auch die risikoärmste und gewinnbringendste Aspirationstiefe wird in der Literatur unterschiedlich beschrieben. In die Sternebrae sollte nicht tiefer als 2,0 bis 3,0 cm eingedrungen werden. Während der aktuellen Studie wurde klar, dass das Auffinden der Sternebrae mittels Ultrasonographie unerlässlich ist. Zusätzlich zeigten Untersuchungen an 3D-Modellen, dass Sternebra 5 am geeignetsten für die Knochenmarkaspiration ist. Sternebra 5 besitzt eine nahezu kugelige Gestalt mit einer dorsoventralen Ausdehnung von ca. 5,2 cm. Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass das Risiko einer Fehlpunktion geringer ist als bisher in anderen Studien angenommen wurde.

Das Knochenmark wurde aus 1,0 und 3,0 cm aspiriert. Es stellte sich heraus, dass eine adäquate Zahl an MSCs bereits in einer Tiefe von 1,0 cm gewonnen werden kann. Diese Erkenntnis trägt somit zur weiteren Risikominimierung bei.

Die Literatur macht auch in Bezug auf die Aspirationsmenge unterschiedliche Angaben, diese schwankt zwischen 5 und 60 ml. In der vorliegenden Studie wurden 5 und 10 ml Knochenmark aus den Sternebrae 4 und 5 aspiriert. Die Auswertung der Ergebnisse erbrachte keinen Unterschied zwischen den beiden Aspirationsmengen. Im Gegenteil, der Anteil an MSCs nimmt proportional mit der Menge des Aspirats ab. Diese Beobachtungen decken sich mit humanmedizinischen Studien.

Aus dem gewonnenen Knochenmark wurden MSCs isoliert und anschließend mit 3 verschiedenen Seren (fetales Kälberserum, FCS, equines standardisiertes Serum, SHS und autologes Serum, AS) kultiviert. Ab einer Subkonfluenz von 80% wurden die MSCs auf ihre Kolonisations- und Migrationsfähigkeit getestet und miteinander verglichen. Es bestand die Annahme, dass es zu einem beschleunigten Wachstum in arteigenem Medium kommt. Diese Hypothese konnte jedoch nicht bestätigt werden. Im Gegenteil, die schnellste und beste Kultivierung war mit fetalem Kälberserum möglich. Aus diesem Grund sollte die Anzucht von equinen MSCs weiterhin mittels FCS durchgeführt werden.

abstract (englisch)

Equine bone marrow has been used for prognoses and diagnoses in the past. Today, it is also used to isolate multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs). These cells are used for the treatment of orthopedic diseases. Many studies have been published, in which MSCs have successfully been injected into the lesion of the damaged tendon. MSCs are intended to reduce the risk of recrudescence, because of their ability to support self-renewal and repair of tissue. Several studies confirm that the recurrence rate decreased and the period of convalescence of the treated horses can be accelerated. However, a number between 1x106 and 1x107 MSCs/ml is needed for injection into the lesion. This great number of MSCs has to be isolated from bone marrow and cultivated as quickly as possible. Although aspiration of bone marrow from the equine sternum is often practiced, transsternal punctures increase the risk. Contradictory information on the equine sternum in the veterinary anatomical literature is identified as causative factor for the occurrence of failed sternal punctures. Although the basic structure of the sternum is described uniformly (Prae, -Meso- and Xyphosternum), different information exists on further details. Especially the structure and number of sternebrae is controversially described. In order to achieve clarity, horse sterna were isolated and data obtained by computed tomography were used to create 3-D models. It turned out that the equine sternum consists of seven similar bony structures (sternebrae). The enumeration of the sternebrae from 1 to 7 omitting the term manubrium sterni was suggested to standardize the nomenclature and therefore provide a uniform basis to describe bone marrow aspiration.

There is also heterogeneous information in veterinary literature regarding technique and depth of bone marrow aspiration. Sternebrae for aspiration are identified in different ways (palpation of different areas of the sternum or by ultrasonography). Further, different recommendations concerning the depth of aspiration exist. During this study it became clear that ultrasonographic control is indispensable. 3-D models showed that sternebra 5 is most suitable for bone marrow aspiration, as it has a nearly spherical shape with a dorsoventral expansion of 5.2 cm on average. This morphological result shows that the risk of misdirected puncture is lower in sternebra 5 than in other sternebrae.

Bone marrow was aspirated from 1.0 and 3.0 cm depth. It appeared that an adequate number of MSCs can already be removed from 1.0 cm depth and thus the risk can be minimized further.

The literature provides different information of the volume of aspiration. It varies between 5 and 60 ml. In the present study, 5 and 10 ml of bone marrow was aspirated from the equine sternum. The analysis showed no difference between these two quantities. In contrast, the number of MSCs decreased proportionally to the amount of aspirated bone marrow. These observations are consistent with studies in human medicine.

After bone marrow isolation, MSCs were cultivated in 3 different sera (fetal calf serum, standardized equine serum and autologous serum). After reaching a subconfluence of 80%, MSCs were tested for their colonization- and migration ability. The hypothesis of an accelerated growth in species-specific medium could not be confirmed. On the contrary, the fastest and best cultivation was possible with fetal calf serum. Therefore, cultivation of MSCs with fetal calf serum is still the most suitable method.

keywords

Mesenchymale Stromazellen, Sternum, Pferd, Mesenchymal stromal cells, sternum, horse

kb

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