Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Janna Engelke

Eignung eines semiquantitativen Testes zur Bestimmung trächtigkeitsassoziierter Glykoproteine zur Prognose bzw. Diagnose von embryonaler und fetaler Mortalität beim Rind

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104679

title (engl.)

Suitability of a semiquantitative ELISA for pregnancy-associated glycoproteins to detect embryonic/fetal mortality in cattle

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/engelkej_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Fertilitätsprobleme stellen in den heutigen hochleistenden Milchviehbetrieben ein bedeutendes und zunehmendes Problem dar. Embryonale Mortalitäten (EM) werden als eine der Hauptursachen für den Rückgang in der Herdenfertilität beschrieben, wobei sich in mehreren Studien im Mittel Raten an frühen EM (bis zum 16. Tag p.i.) von 35 % und an späten EM (16.-42. Tag p.i.) von 22 % ergaben (Cerri et al. 2009a; Romano et al. 2007; Sartori et al. 2002; Cartmill et al. 2001a; Humblot 2000; Humblot 1986). Die Diagnostik ist allerdings schwierig und auf den oftmals kurzen Zeitraum begrenzt, in dem der abgestorbene Embryo (ohne detektierbaren Herzschlag) noch nicht ausgestoßen/resorbiert wurde. Neben der transrektalen Ultraschalluntersuchung (TRU) könnte eine weitere Diagnosemöglichkeit der Nachweis von bovinen trächtigkeitsassoziierten Glykoproteinen (bPAGs) bieten, denn bei EM wurde ein Abfall der bPAG-Konzentration im maternalen Blut beschrieben (Breukelman et al. 2012; Thompson et al. 2010; López-Gatius et al. 2007; Szenci et al. 2000). Allerdings ist bisher nicht ausreichend untersucht, inwiefern auch momentan auf dem Markt übliche semiquantitative bPAG‑Testverfahren zur Diagnose von EM oder fetalen Mortalitäten (FM) genutzt werden könnten. Ziel der vorliegenden Dissertation war es daher zu untersuchen, ob über einen semiquantitativen bPAG-Nachweis in Blut- oder Milchproben eine Diagnose oder sogar Prognose von EM/FM aufgrund des Unterschreitens eines bestimmten OD-Grenzwertes in praxi möglich ist. Für diesen Zweck wurde zunächst eine Validierung der semiquantitativen ELISA für Blut- und Milchproben zur bPAG‑Bestimmung (sqPAG-ELISABlut/Milch) durchgeführt und es konnte gezeigt werden, dass beide Testverfahren im OD-Bereich von 0,4-2,8 (sqPAG-ELISABlut) bzw. von 0,3-3,0 (sqPAG-ELISAMilch) die analytischen Voraussetzungen bieten, um einen Abfall der bPAG-Konzentration in Blut/Milch zu detektieren. Anschließend sollte die Festlegung eines OD-Bereiches für den sqPAG-ELISABlut erfolgen, über den die Prognose/Diagnose von EM/FM allein durch Bestimmung der bPAG-ODs möglich sein könnte. Zu diesem Zweck wurde zum einen eine retrospektive Datenauswertung (Fall-Kontroll-Studie, FKS) von einem Teil der von Januar 2012 bis März 2013 im Endokrinologischen Labor der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover eingegangenen Proben durchgeführt. Bei 141 von 208 Tieren mit einer Probe im OD‑Bereich von 0,4-1,5 und bei 208 von 2176 Tieren mit einer Probe im OD-Bereich > 1,5 wurde der Fortbestand der Trächtigkeit über Befragung der Landwirte ermittelt (= partielle Verifikation). Zum anderen wurden in einer Feldstudie bei 296 Tieren die Ergebnisse der sqPAG-ELISABlut/Milch-Analyse mit der TRU als Gold-Standard verglichen und das Aufrechterhalten der Trächtigkeit verfolgt. In der FKS konnte festgestellt werden, dass 45 % der Kühe mit einer OD < 1,5 und 13 % der Kühe mit einer OD > 1,5 die Trächtigkeit nicht aufrechterhielten. Betrachtet man die Embryonalphase, so konnte bei 55 % der Tiere kein Fortbestand der Trächtigkeit bei einem Grenzwert von < 1,5 festgestellt werden. Bei alleiniger Betrachtung der EM/FM bis zum 100. TT verringerte sich die EM/FM-Rate für die Kühe mit einer OD > 1,5 auf 2 %. Zur Grenzwertfindung wurde eine Receiver-Operating-Characteristic-(ROC)-Kurvenanalyse durchgeführt, wobei die Sensitivitäten (SEN) und Spezifitäten (SPE) nach Begg und Greenes (1983) korrigiert wurden. Der OD‑Grenzwert von 1,5 bot die bestmöglichen Ergebnisse (SEN = 78 %; SPE = 87 %). Hierdurch konnte festgestellt werden, dass die bPAG-Analyse nicht zu einer sicheren Diagnose von EM/FM bis zum 100. TT anwendbar war. In der praktischen Anwendung während der Feldstudie ergaben sich für die Analyse der Blut- und Milchproben zur Trächtigkeitsdiagnostik exklusive der zusätzlichen Erkennung von EM/FM (tragend vs. nicht tragend) gute Ergebnisse (SEN = 97 %; SPE = 93-94 %). Für die Prognose/Diagnose von EM/FM über den sqPAG-ELISABlut ergab sich für den OD-Grenzwert von 1,5 unter Praxisbedingungen in der Feldstudie lediglich eine SEN von 27 % bei einer SPE von 97 % und der positive prädiktive Wert lag bei 62 %. Für den sqPAG-ELISAMilch lagen die SEN bei 4 % und die SPE bei 99 %. Es kann daher festgehalten werden, dass über die semiquantitative bPAG‑Analyse weder in Blut noch in Milch alle „erkrankten“ Tiere selektiert werden konnten, aber, dass von den selektierten Tieren (sqPAG-ELISABlut) 62 % EM/FM zeigten. Hinsichtlich der Prognose/Diagnose von EM/FM konnte in der Feldstudie weitergehend gezeigt werden, dass über eine Kombination von TRU und sqPAG‑ELISABlut-Analyse sowohl eine Diagnose (TRU: kein Embryo darstellbar, bPAG-OD: fraglich/positiv) als auch eine Prognose von EM/FM (TRU: Embryo mit Herzschlag darstellbar, bPAG-OD: negativ/fraglich) bis zum 100. TT möglich war. Hierfür ergaben sich für den sqPAG‑ELISABlut die zuverlässigsten Ergebnisse bei einem OD-Grenzbereich für fragliche Tiere von 0,4-1,5 mit einer SEN von 84 % und einer SPE von 98 %. Es kann zusammengefasst werden, dass die laboranalytische Bestimmung ausschließlich der semiquantitativen bPAG-Ergebnisse als ein Werkzeug zur Selektion gefährdeter Tiere genutzt werden kann, bei denen eine Nachkontrolle in jedem Fall durchgeführt werden sollte. Überdies bietet die Kombination von TRU-Befunden und sqPAG-ELISABlut-Analyse additive Informationen in der Diagnostik frühtragender Tiere und es könnte in Zukunft möglich sein bei Kühen, bei denen eine EM/FM prognostiziert wird, therapeutische Maßnahmen einzuleiten. Diesbezüglich wäre es von besonderem Interesse zukünftig die genauen Funktionen und Wirkungsmechanismen der bPAG-Moleküle zu untersuchen.

abstract (englisch)

Fertility problems in cows have increased during the last decades and play an important role in dairy farms. Embryonic mortality (EM) is one of the main reason for the declining fertility. Early EM occurs in 34.6 % and late EM in 22.1 % of pregnancy (mean value of different studies) (Cerri et al. 2009a; Romano et al. 2007; Sartori et al. 2002; Cartmill et al. 2001a; Humblot 2000; Humblot 1986). However, the diagnosis of EM remains difficult as the period of time between the cessation of the embryonic heartbeat and the expulsion/resorption of the embryo is short. Besides detecting EM by transrectal ultrasonography (TRU), the diagnosis of EM might be possible by measuring bovine pregnancy-associated glycoproteins (bPAGs) in blood, as a decline in bPAG concentration could already be demonstrated in the maternal blood in cases of EM and fetal mortality (FM) (Breukelman et al., 2012; Thompson et al., 2010; López-Gatius et al., 2007; Szenci et al., 2000). However, it is not known yet whether commercially available semiquantitative laboratory tests for bPAG detection are useful for diagnosing EM. Therefore, the aim of the present study was to investigate if a decline of the optical density (measured by a semiquantitative enzyme-linked immunosorbent assay in blood/milk; sqPAG-ELISABlood/Milk) below a cut-off value might be reasonable to diagnose or even to predict EM/FM. For this purpose, firstly, the validation of the sqPAG-ELISABlood/Milk was performed. The results revealed that both ELISAs fulfill the necessary requirements for measuring a decline of the bPAG level within an OD range of 0.4-2.8 (sqPAG-ELISABlood) and 0.3-3.0 (sqPAG-ELISAMilk), respectively. Secondly, an OD range for diagnosis/prediction of EM/FM had to be established. Therefore, a retrospective data evaluation (case control study) was accomplished on the basis of bPAG samples sent to the endocrinological laboratory (University of Veterinary Medicine, Hannover) between January 2012 and March 2013. The maintenance of pregnancy was checked in 141 (of 208) cows with an OD of 0.4-1.5 and in 208 (of 2176) cows with an OD > 1.5 by interrogating the respective dairy farms. A field study was conducted to compare the results of the sqPAG-ELISABlood/Milk to the results of TRU as gold standard (n = 296 cows). The results of the case control study lead to the conclusion that 45 % of the cows with an OD < 1.5 as well as 13 % of the cows with an OD > 1.5 had EM/FM. In the embryonic period (up to day 42), 55 % of the cows with an OD < 1.5 showed EM. A receiver-characteristic-operation curve analysis was performed to define a cut-off value. By the use of a mathematical correction formula developed by Begg and Greenes (1983), this analysis included the corrected sensitivity (SEN) and specificity (SPE), and a cut-off value of 1.5 offered the best results (SEN = 78 %; SPE = 87 %). However, based on this data the bPAG analysis did not lead to an appropriate and reliable diagnosis of EM/FM. The outcome of the field study using sqPAG-ELISABlood and sqPAG-ELISAMilk (SEN = 97 %; SPE = 93-94 %) showed reliable results for pregnancy diagnosis. Under field conditions, the prediction/diagnosis of EM/FM using the sqPAG-ELISABlood with a cut-off value of 1.5 revealed only a SEN of 27 % and a SPE of 97 %. The positive predictive value was 62 %, which implicates that 62 % of the cows with an OD < 1.5 had EM/FM. For the sqPAG-ELISAMilk, the SEN was 4 % and the SPE 99 %. It can be concluded that the bPAG analysis cannot be used to select an appropriate portion of cows with EM/FM. However, the results of the present study clearly showed that the combination of TRU and bPAG results permits the diagnosis (TRU: no embryo visible; bPAG positive/questionable) and even the prediction (TRU: embryo with heartbeat visible; bPAG negative/questionable) of EM/FM up to day 100 of pregnancy. For this purpose, the best results were given by a questionable OD range from 0.4-1.5 (SEN = 84 %; SPE = 98 %). In conclusion, the diagnosis of EM/FM exclusively by the use of a semiquantitative bPAG analysis could be applied to select cows suspicious of EM/FM in order to recheck them. Moreover, the combination of TRU and bPAG analysis can clearly enhance the early pregnancy diagnosis providing additional information so that it might be possible to treat those cows suspicious of EM/FM in the future. Referring to this assumption, further investigations should be focused on the functions and mechanisms of the bPAG molecules with regard to the establishment and the maintenance of pregnancy.

keywords

bovine trächtigkeitsassoziierte Glykoproteine, embryonale Mortalität, Diagnose, bovine pregnancy-associated glycoproteins, embryonic mortality, diagnosis

kb

5.117