Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Christopher Eidam

Molecular analysis of multiresistant Mannheimia haemolytica isolates with particular reference to novel macrolide resistance genes and variants of the integrative and conjugative element ICEPmu1

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95- 105439

title (ger.)

Molekulare Analyse multiresistenter Mannheimia haemolytica-Isolate unter besonderer Berücksichtigung neuer Makrolid-Resistenzgene sowie neuer Varianten des integrativen und konjugativen Elements ICEPmu1 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/eidamc_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Seit vielen Jahrzehnten ist Mannheimia haemolytica ein veterinärmedizinisch ausgesprochen relevanter Krankheitserreger und das Thema vieler wissenschaftlicher Studien, da der Organismus als einer der wesentlichen bakteriellen Krankheitserreger boviner Atemwegsinfektionen gilt. Allerdings werden immer häufiger M. haemolytica-Isolate entdeckt, die gegen ein oder mehrere Antibiotika resistent sind, was die Behandlung boviner Atemwegsinfektionen erschwert. Die Ziele der vorliegenden PhD-These waren es (i) die Effekte der Makrolidresistenzgene erm(42), msr(E) und mph(E) auf die neusten Makrolidantibiotika Gamithromycin und Tildipirosin, zu untersuchen, (ii) das Genom von M. haemolytica 42548 vollständig zu sequenzieren und (iii) das in diesem Stamm gefundene und Multiresistenz vermittelnde integrative und konjugative Element (ICE) ICEMh1 zu analysieren.

Im ersten Teil dieses Ph.D. Projektes wurden die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK-Werte) für Gamithromycin und Tildipirosin von 40 Pasteurella multocidaund 29 M. haemolytica Isolaten untersucht, welche die Gene erm(42) und/oder msr(E)-mph(E) oder keine Makrolidresistenzgene tragen (KAPITEL 4). Die Empfindlichkeitstestung ergab, dass in Gegenwart des Gens erm(42) die MHK-Werte für Tildipirosin bei M. haemolytica und P. multocida stark erhöht waren, während es nur eine geringe Erhöhung der MHK-Werte für Gamithromycin gab. Die Makrolidresistenzgene msr(E)-mph(E) hingegen erhöhten die MHK-Werte für Gamithromycin deutlich stärker als die MHK-Werte für Tildipirosin.

Im zweiten Teil dieses Ph.D. Projektes wurden mehrere multiresistente, plasmidfreie M. haemolytica-Isolate hinsichtlich der Präsenz eines ICEs untersucht. Das M. haemolytica-Isolat 42548 wurde einer Gesamtgenom-Sequenzierung mittels 454 und Illumina, mit anschließendem Lückenschluss und Genomanalyse, unterzogen (KAPITEL 5). Das Genom von M. haemolytica 42548 hat eine Größe von 2,731,870 bp und kodiert für 2888 Gene, inklusive 6 rRNA Genclustern und 61 tRNA Genen. Die 2807 protein-kodierenden Gene beinhalten 55 mögliche Transposasegene, 5 Antibiotika-Resistenzgene und eine CRISPR Region des I-C/Dvulg Subtyps. Außerdem wurde ein mit ICEMh1 bezeichnetes ICE identifiziert.

Im dritten Teil dieses Ph.D. Projektes wurde ICEMh1, das erste in M. haemolytica gefundene ICE, charakterisiert und analysiert (KAPITEL 6). ICEMh1 hat eine Größe von 92345 bp und trägt 107 Gene, inklusive fünf Antibiotika-Resistenzgene, die in zwei Resistenzgenregionen mit Größen von etwa 7,4 und 3,3 kb enthalten sind. Die in diesen Resistenzgenregionen befindlichen Resistenzgene vermitteln Resistenz gegenüber den folgenden antimikrobiellen Wirkstoffen: Kanamycin/Neomycin (aphA1), Streptomycin (strA und strB), Sulfonamide (sul2) und Tetracycline [tetR-tet(H)]. Die ersten 29497 bp von ICEMh1 stimmen mit einem Teil einer möglichen ICE Region eines anderen M. haemolytica Genoms überein. Die übrigen 63,848 bp von ICEMh1 zeigen deutliche Homologie zu Sequenzen des Multiresistenz-vermittelnden ICEPmu1 aus Pasteurella multocida auf. Diese Beobachtung deutet auf eine mögliche Rekombination zwischen einem gemeinsamen Vorfahren von ICEMh1 und ICEPmu1 und der möglichen ICE-Region eines anderen M. haemolytica Genoms hin. Die Aktivität von ICEMh1 wurde dadurch bestätigt, dass das Element via Konjugation zu P. multocidaübertragen werden konnte. 

abstract (englisch)

For many decades Mannheimia haemolytica has been an important veterinary pathogen and subject of numerous studies, due to its involvement in the bovine respiratory disease (BRD) complex. However, a growing number of isolates show resistance to one or more antimicrobial agents, making the treatment of BRD increasingly difficult. The aims of this study were (i) to determine the effect of the new macrolide resistance genes erm(42), msr(E) and mph(E) on the latest approved macrolides gamithromycin and tildipirosin, (ii) to completely sequence the genome of M. haemolytica 42548, , and (iii) to analyze the multiresistance-conferring integrative and conjugative element (ICE) ICEMh1 identified in M. haemolytica 42548.

In the first part of this Ph.D. project, 40 Pasteurella multocidaand 29 M. haemolytica isolates that harbor the genes erm(42) and/or msr(E)-mph(E) or no macrolide resistance genes were screened for their minimum inhibitory concentrations (MICs) of gamithromycin and tildipirosin (CHAPTER 4). Susceptibility testing revealed, that erm(42) distinctly increased the MIC to tildipirosin, but had only little effect on the MIC to gamithromycin in M. haemolytica and P. multocida. However, msr(E)-mph(E) had a different effect. They caused a prominent increase in the gamithromycin MICs, but only a slight increase in the tildipirosin MICs.

In the second part of this Ph.D. project, several multiresistant, plasmid-free M. haemolytica isolates were screened for conserved components of an ICE structure. The M. haemolytica isolate 42548 was then subjected to whole genome sequencing by 454 and Illumina, including subsequent gap closure and analysis (CHAPTER 5). The genome of M. haemolytica 42548 has a size of 2,731,870 bp, harbors 2,888 genes, including 6 rRNA gene clusters and 61 tRNA genes. The 2,807 protein-encoding genes include 55 putative transposases, 5 antimicrobial resistance genes and one CRISPR region of the I-C/Dvulg subtype. Additionally, an ICE, designated ICEMh1, was identified.

In the third part of this Ph.D. project, the first ICE from M. haemolytica, the ICEMh1, was characterized and analyzed (CHAPTER 6). ICEMh1 has a size of 92,345 bp and harbors 107 genes, including five resistance genes within two resistance gene regions of approximately 7.4 kb and 3.3 kb in size. These resistance gene regions comprise the following genes for resistance to kanamycin/neomycin (aphA1), streptomycin (strA and strB), sulfonamide (sul2) and tetracycline [tetR-tet(H)]. The first 28,497 bp of ICEMh1 match with a putative ICE region found in another M. haemolytica genome, while the remaining 63,848 bp of ICEMh1 correspond to sequences found in ICEPmu1. This suggests the possibility of a recombination event between a common ancestor that ICEMh1 shares with ICEPmu1, and a putative ICE region of another M. haemolyticagenome. Furthermore, the mobility of ICEMh1 could be shown by transferring the element to P. multocida by conjugation.

 

keywords

Integrative und konjugative Elemente, Mannheimia haemolytica, Gesamtgenom-Sequenzierung, integrative and conjugative elements, Mannheimia haemolytica, whole genome sequencing 

kb

1.580