Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Sonja Ehrhardt

 

 Etablierung einer primären bovinen Hepatozytenzellkultur als Modell zur Untersuchung der Expression des Wachstumshormonrezeptors

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109714

title (eng.)

Establishment of a cell culture system for primary bovine hepatocytes to analyse the growth hormone receptor expression

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ehrhardts_ss17.pdf

abstract (deutsch)

Es ist bekannt, dass es in der Hochträchtigkeit von Milchkühen in den letzten Wochen ante partum zu einer hepatischen Wachstumshormon-Resistenz kommt,  bei der die Ansprechbarkeit des GH auf den GHR sinkt, so dass es zu einem Absinken der IGF-I- Konzentration kommt (Piechotta et al., 2014; Radcliff et al., 2003a). Bislang konnte am Tiermodell nicht hinreichend geklärt werden, welche Faktoren zu dieser reduzierten GHR Expression führen. Es ist hinreichend beschrieben, dass es im peripartalen Zeitraum der Milchkuh zu enormen endokrinen, immunologischen und metabolischen Veränderungen kommt. Ziel dieser Arbeit war es daher, ein in vitro Modell zu etablieren,  um zukünftig gezieltere Untersuchungen am GHR und dessen Regulationsmechanismen zu ermöglichen.  Aus Aspekten des Tierschutzes sowie aus Kostengründen wurde sich für die Etablierung einer Zellkultur aus Schlachthofmaterial entschieden, um Tierversuche, gerade da es sich hier um große Nutztiere handelt, zu reduzieren. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll zur Isolation der primären bovinen Hepatozyten sowie der folgenden Kultivierung der Zellen etabliert. Ein Vorversuch mit frisch isolierten Rattenhepatozyten nach gut etabliertem Protokoll wurde durchgeführt, um später die Expressionen von GHR1A und IGF-I, aber auch die Morphologie der Ratten- und bovinen Zellen miteinander vergleichen zu können. Für die Etablierung des Perfusionsprotokolls für die Rinderleber wurden insgesamt 38 Leberstücke perfundiert. Während der Etablierungsphase wurden einige Modifikationen zum Ausgangsprotokoll durchgeführt. Das verwendete Ausgangsprotokoll bildete hier ein gut etabliertes Protokoll zur Isolation humaner primärer Hepatozyten der Charité Berlin. Dieses basiert auf der Grundlage einer Two-Step-Kollagenaseperfusion nach Seglen (1972). Nach etabliertem Endprotokoll wurden in dieser Arbeit 13 Leberstücke perfundiert. Die Vitalität der isolierten bovinen Hepatozyten lag im Mittel bei 60,5% ± 9,6 bei einer mittleren Zellausbeute von 5,1x106 Zellen/ml Zellsuspension. Diese Werte liegen im Vergleich zu anderen Arbeiten zur Isolation primärer boviner Hepatozyten aus Schlachthofmaterial etwas niedriger (Giantin et al., 2012; Panda et al., 2015). Unterschiede zur eigenen Arbeit finden sich vor allem in der Pufferzusammensetzung und der Technik der Perfusion, obwohl beide Autoren ebenfalls eine modifizierte Two-Step-Kollagenaseperfusion anwenden. Die Kultivierung der bovinen Hepatozyten erfolgte in dieser Arbeit vergleichend im Monolayer und in der Sandwich Kultur als dreidimensionales Kultursystem. Anhand einer Lebend/Tot Färbung konnte an den Versuchstagen die Vitalität der Zellen gut mikroskopisch analysiert, und die jeweiligen morphologischen Veränderungen festgestellt werden. Anhand der morphologischen Ergebnisse sowie der Laboranalysen der Parameter Harnstoff, LDH und der Apoptosemarker BAX und FasL kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Sandwich Kultur der Monolayer Kultur in der Vitalität der Zellen überlegen ist. In der Sandwich Kultur konnten über 14 Tage vitale Zellen nachgewiesen werden. Nach dieser Zeit wurde der Versuch beendet. Allerdings wurden auch in der Monolayer Kultur bis zu Tag 10 vitale Zellen detektiert. Laut Literaturangaben spielt die Ausprägung von Zell-Zellkontakten sowie einer charakteristischen polygonalen Zellmorphologie eine entscheidende Rolle für die Differenzierung der Hepatozyten in der Kultur, und somit auch für die Ausübung hepatozytenspezifischer Funktionen (Vinken et al., 2006). In der eigenen Arbeit konnten in der Sandwich Kultur diese morphologischen Charakteristika nachgewiesen werden, wodurch auf eine Funktionalität der Hepatozyten spekuliert werden kann. Da die etablierte Zellkultur zukünftig als Grundlage für Studien am GHR verwendet werden soll, wurden die Expressionen der mRNA von GHR1A und IGF-I analysiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Expression des GHR sowohl bei Ratten- als auch bei Rinderhepatozyten zunächst deutlich sinkt und in der Sandwich Kultur ab Tag 3 langsam ansteigt. Auf der Grundlage dieser Arbeit kann in weiterführenden Arbeiten die Vitalitätsrate der bovinen Hepatozyten während der Isolation und der Kultivierung durch Modifikationen noch erhöht werden. 

abstract (englisch)

It is already known, that dairy cows show a growth hormone resistance in the last few weeks before calving associated with a decrease in IGF-I concentration due to reduced responsiveness of the growth hormone receptor (GHR) (Piechotta et al., 2014; Radcliff et al., 2003a). However the underlaying mechanism is still not completely understood. Several endocrine, immunological and metabolic changes take place in the transition period of dairy cows. The aim of this study was to establish a cell culture system for primary bovine hepatocytes to allow targeted studies of factors influencing the GHR expression. To reduce animal research, especially because it concerns great animals, hepatocytes from abattoir derived livers were used. In this study a protocol for isolation of the primary bovine hepatocytes as well as a protocol for cultivation of these cells was established. Therefore a preliminary test with primary rat hepatocytes, isolated using a well- established protocol was carried out to compare the morphology and the expressions of GHR1A and IGF-I with the bovine hepatocytes. For the establishment of the isolation protocol for bovine hepatocytes 38 livers were perfused. Some modifications were made to the first used protocol which was a well-established protocol for isolation of primary human hepatocytes from the Charité Berlin, based on the “Two-Step-Collagenase Perfusion” by Seglen (1972).

According to the established isolation protocol 13 livers were perfused in this study. The viability of the isolated cells following Easycoll separation was 60.5% ± 9.6 in the middle with a yield of viable cells of 5.1x106 cells/ml cell suspension. This result was slightly lower compared to other studies for isolation of bovine primary hepatocytes from abattoir derived liver (Giantin et al., 2012; Panda et al., 2015).  Differences to the present study can be found in the composition of the used perfusion buffers and in the used perfusion technique although all are based of the Two-Step-Collagenase Perfusion by Seglen (1972).

The cultivation of the primary bovine hepatocytes was performed comparative in a monolayer and a sandwich culture system. On the basis of a live/dead staining the vitality and morphologic changes of the cultivated cells were well detected by microscopy. Due to the analyzed parameters urea and LDH as well as the analyzed apoptotic markers BAX and FasL and morphological criteria the present study indicates the advantage of the sandwich culture compared to the monolayer. Viable cells could be detected over 14 d in the sandwich culture. It is already known, that the development of cell-cell-contacts and the hepatocytes characteristic morphology of polygonal shape plays an important role for the differentiation of the cultured hepatocytes and their liver specific functions (Vinken et al., 2006). In the sandwich culture these characteristics were detected in this study whereby functionality of the cultured hepatocytes can be speculated. Because of the cell culture should be the basis for further studies of the GHR, the expressions of mRNA of GHR1A and IGF-I were analyzed. The results of this study pointed out, that the expression of GHR1A transcript slowly increased by day 3 in the sandwich culture. For that reason future studies of the GHR should not be done before day 3 in culture. In conclusion, viable hepatocytes can be gathered from abattoir derived livers and cultured in Sandwich culture. This established technique provides the basis for different studies with adult bovine primary Hepatocytes. In continuing studies it should be possible to increase the viability and cell yield with some modifications.

keywords

Primäre bovine Hepatozyten, Zellisolation, Sandwichkultur, Primary bovine hepatocytes, cell isolation, sandwich culture

kb

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