Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Anna Effenberg

Alternative therapies for Morbus Parkinson: Effects of tactile stimulation in a rodent model of Parkinson´s disease and induced pluripotent stem cells as a new source for neurotransplantation – therapy

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104669

title (ger.)

Alternative Therapien für Morbus Parkinson: Effekte taktiler Stimulation im Ratten Modell der Parkinsonschen Krankheit und induzierte pluripotente Stammzellen als neue Quelle für die Neurotransplantations-Therapie.

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/effenberga_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Das Hauptmerkmal des Morbus Parkinson (MP) ist der progressive Verlust dopaminerger (DAerger) Neurone der Substantia nigra pars compacta (SNc) und der daraus resultierenden Dopamin (DA) Verarmung in den Basalganglien (BG). Diese Pathologie führt zu den typischen Symptomen: Bradykinese, Ruhetremor, Steifheit und Haltungsinstabilität. Zur Zeit sind nur Therapien vorhanden, die zwar die Symptome des MP lindern, dem progressiven Charakter allerdings nicht entgegenwirken. Daher ist es nötig, alternative Therapien zu entwickeln. Der neuste Ansatz ist die Transplantationstherapie DAerger Neurone in das Striatum (STR), um die BG von hier aus wieder mit DA zu versorgen und den physiologischen Status zu rekonstruieren. Allerdings brachten klinische Studien in Bezug auf Reinnervation, Überleben der Zellen im Transplantat und funktionelle Entwicklung sehr heterogene Ergebnisse hervor. Weitere Schwierigkeiten stellen die limitierte Versorgung mit Spendergewebe und ethische Debatten über den Gebrauch fetalen Gewebes dar. Daher wurden bereits neurotrophe Faktoren (NTF) eingesetzt, um diesen Problemen entgegen zu wirken. Die zu transplantierenden Zellen wurden beispielsweise via genetischer Modifikation mit dem NTF Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) versorgt, welcher nachweislich das Überleben und Auswachsen DAerger Neurone verbesserte.

Das Ziel unserer Studie war die o.g. limitierenden Faktoren der Transplantationstherapie zu reduzieren. Einerseits sollte das lädierte DAerge System durch endogene FGF-2 Produktion, hervorgerufen durch taktile Stimulation (TS), gestärkt werden. Andererseits haben wir die in vitro und in vivo Eigenschaften DAerger Neurone überprüft, welche aus humanen induzierten Stammzellen (human induced pluripotent stem cells, iPSCs) abgeleitet wurden. iPSCs werden aus somatischen Zellen durch Reprogrammierung in den pluripotenten Zustand einer Stammzelle zurück versetzt. Ihre Generierung beeinflusst den Spender somit nicht nachteilig.

Es wurde gezeigt, dass die Anwendung von TS an adulten kortikal lädierten Ratten (mediale Frontalkortex-Aspiration oder sensorimotorisches Hirnschlag-Modell) zu einer Verbesserung von Beeinträchtigungen motorischer Fähigkeiten sowie zu verbesserten morphologischen Parametern, wie der Dendritenlänge präfrontaler kortikaler Neurone, führte. Diese vorteilhaften Effekte traten gemeinsam mit erhöhten FGF-2 Konzentrationen, sowohl in der Haut, als auch im Gehirn auf. Außerdem zeigten verschiedenste Studien die positiven Auswirkungen von TS auf Frühgeburten oder immundefiziente Menschen bzw. Hospizpatienten. In unserer Studie untersuchten wir die Effektivität von TS auf gesunde Ratten und Ratten im MP-Modell. Die Hypothese umfasste eine endogene FGF-2 Produktion, welche, übertragen auf das menschliche Modell, das Überleben und die Integration DAerger Transplantate verbessern könnte. Wir fanden heraus, dass die striatale 6-OHDA Läsion selber zu einem Anstieg astroglialer Fgf2 Transkriptionslevel führte. Diese wurden allerdings nicht durch die TS-Behandlung weiter angehoben. Bei gesunden Ratten hingegen induzierte TS einen transienten kurzzeitigen Anstieg von Fgf2 im STR sowie von Bdnf, Grin1 und Fgf2 im Hippocampus. Dennoch konnten Verhaltens- sowie histologische Analysen keinen vorteilhaften Effekt bei Ratten im MP Modell nachweisen, wenn TS einen Tag nach der Läsion und die folgenden 14 Tage angewendet wurde.

Die Reprogrammierung humaner somatischer Zellen, in diesem Fall Nabelschnurblutzellen (human cord blood cells, hCB), in iPSCs repräsentiert eine Zellquelle mit den gleichen Eigenschaften wie embryonale Stammzellen, die sich in neuronale Vorläuferzellen differenzieren lässt. So könnte man den Problemen des limitierten Spendergewebes sowie den ethischen Debatten bezüglich der Verwendung von fetalem Gewebe entgegenwirken. In dieser Studie haben wir zwei Protokolle verglichen, die durch die Verwendung von FGF-2 (Protokoll I) oder Dorsomorphin/ SB (Protokoll II) nachweislich effektiv die Neuralisierung von humanen iPSCs induzieren. Untersucht wurden die in vitro und in vivo Eigenschaften nach intrastriataler Transplantation in gesunde und lädierte Ratten. Die Verwendung von Protokoll II führte in vitro zu einer früheren Expression des neuronalen Vorläufer Markers (Pax6) als bei Protokoll I. Nach 21 Tagen der finalen Differenzierung konnte bei beiden Protokollen eine vergleichbare Anzahl von Neuronen, die positiv für den neuronalen Marker Tuj1 waren, nachgewiesen werden. Die Anzahl von TH+ DAergen Zellen war bei Protokoll II allerdings signifikant höher als bei Protokoll I. In vivo zeigten iPSCs, welche mit Protokoll II differenziert wurden, nach drei Wochen in lädierten Tieren weniger Proliferationspotential als bei Protokoll I in gesunden Ratten. Das Volumen des Transplantats war bei beiden Protokollen nach drei Wochen erhöht. Die Differenzierung mittels Protokoll I brachte in vivo mehr TH+ Zellen, allerdings ohne Faserwachstum, hervor. Hingegen konnten bei Protokoll II zwar weniger TH+ Zellen, dafür aber Faserwachstum bis hin zu Reinnervation von Teilen des STR nachgewiesen werden.

Zusammenfassend kann man also sagen, dass die Verwendung von DM und SB nach 21 Tagen der finalen Differenzierung eine geeignetere, weniger zeitintensive und daher kosteneffizientere Methode darstellt, um DAerge Neuronen aus hCBiPSCs zu generieren.

Die Verwendung von TS als Transplantat-unterstützende Methode und iPSCs als alternative Zellquelle für die Transplantationstherapie sind in meinen Augen geeignete Mittel, um die limitierenden Faktoren dieses Therapieansatzes zu reduzieren. Es ist durch die o.g. Studien allerdings deutlich geworden, dass weitere Experimente und Nachforschungen notwendig sind, um die Methoden weiter zu verbessern und verlässlichere Ergebnisse zu produzieren

abstract (englisch)

The hallmark of Parkinson´s Disease (PD) is the progressive loss of dopaminergic (DAergic) neurons in the substantia nigra pars compacta (SNc) and the resulting dopamine (DA) depletion in the basal ganglia (BG). This pathology leads to the typical symptoms: bradykinesia, tremor at rest, rigidity, and postural instability. At the moment, only therapies are available that ameliorate the symptoms, but do not counteract the neurodegenerative character of the disease. Hence, new therapies are in need. The most recent approach is the cell replacement therapy. Here, intrastriatal grafts of DAergic neurons are meant to restore the DA content, reinnervate the host striatum (STR) and re-establish the physiologic state of the BG. Clinical studies, however, revealed very heterogeneous outcomes regarding reinnervation, graft survival, and functional recovery. Further limitations of this therapy are limited donor tissue supply and ethical debates concerning the use of fetal tissue. In order to overcome these problems, neurotrophic factors (NTFs) have been used in combination with DAergic grafting experiments. For example, genetic modification was used in order to supply the cells with fibroblast growth factor-2 (FGF-2), which has been shown to mediate neurite survival and outgrowth.

The aim of our studies was to ameliorate the limiting factors of cell replacement therapy. On the one hand, we tried to support the lesioned DAergic system via endogenous FGF-2 production induced by tactile stimulation (TS). On the other hand, we evaluated the in vitro and in vivo properties of DAergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). These are somatic cells, which develop via reprogramming the pluripotent status of stem cells and whose generation therefore does not harm the donor.

TS applied to adult rats after cortical injury (medial frontal cortex aspiration or sensorimotor pial stripping stroke model) has been previously shown to ameliorate behavioral impairments and to improve morphological parameters like dendritic length of prefrontal cortical neurons. These beneficial effects occurred simultaneously with increased FGF-2 concentrations in both, skin and brain of stimulated rats. Furthermore, numerous studies proved different positive effects of TS for example in preterm neonates and immunodeficient or hospice patients. Here, we examined the effectiveness of TS in healthy rats and rats in a PD model. Our hypothesis included an endogenous production of FGF-2, which could, transferred to a human model, enhance the DAergic graft survival and integration. We found that the striatal 6-OHDA lesion itself induced a long-term increase of astroglial Fgf2 transcript levels, but was not further increased by TS. In contrast, TS applied to healthy rats caused a transient short-term increase of Fgf2 in the STR and Bdnf, Grin1, and Fgf2 in the hippocampus. Moreover, behavioral and histological analyses did not prove a beneficial effect of TS, applied for two weeks starting one day after lesion, on hemiparkinsonian rats.

Reprogramming of human somatic cells, in this case human cord blood (hCB) cells, into iPSCs (hCBiPSCs) produces a cell source that has the same characteristics of embryonic stem cells, that can be differentiated into neuronal precursors, and might accelerate the limited donor tissue supply and the ethical debates concerning the use of fetal material in cell replacement. In the present study, we compared two protocols shown to efficiently induce neuralization from human iPSCs by using FGF-2 (protocol I) or Dorsomorphin/ SB (inhibitors of transforming growth factor-β and bone morphogenetic protein signaling, protocol II). We evaluated the in vitro and in vivo properties after intrastriatal transplantation in healthy and lesioned rats. The utilisation of protocol II yielded in an earlier neural precursor marker (Pax6) expression in vitro than with utilization of protocol I. After 21 days of final maturation, a comparable number of neurons positive for the neural marker Tuj1 was observed in the total cell population under both culturing conditions. The number of TH+ DAergic cells was significantly elevated using protocol II compared to protocol I. In vivo iPSCs differentiated with protocol II showed less proliferation potential after three weeks in lesioned animals than cells of protocol I in healthy rats. Graft volume increased over three weeks in both protocols. iPSCs differentiated with protocol I showed more TH+ cells, but without distinct fiber outgrowth. Protocol II revealed less TH+ cells, but fiber outgrowth and even reinnervation of the STR after three weeks. In summary, utilization of DM and SB induces after 21 days of final maturation a more convenient, less time consuming and, therefore, more cost effective in vitro differentiation of hCBiPSCs.

The usage of TS as a graft supporting method and iPSCs as an alternative cell source for cell replacement therapy are, in my opinion, useful tools in order to overcome the limiting factors in DAergic transplantations in PD. Further investigations, however, are necessary for improvement and reliable outcomes of these methods.

keywords

Parkinson, taktile Stimulation, Neurotransplantation; Parkinson, tactile stimulation, neurotransplantation

kb

2.568