Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Elke Eckelt

FurA and FurB – the impact of two transcriptional metalloregulators on Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis stress response and metal homeostasis

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105429

title (ger.)

FurA und FurB – der Einfluss zweier transkriptioneller Metalloregulatoren auf die Stressantwort und Metallhomöostase von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/eckelte_ws14.pdf

abstract (deutsch)

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose, einer chronisch granulomatösen Enteritis bei Wiederkäuern. Eine Beteiligung des Erregers an der Entstehung von humanen Autoimmunerkrankungen wie Morbus Crohn und Diabetes Typ I (u.a.) wird diskutiert. MAP weist einen einzigartigen Gewebetropismus für den Darm auf und ist in der Lage im Phagosom subepithelialer Makrophagen zu überleben. Der Darmtropismus geht mit langen Sequenzpolymorphismen (LSPs) im Genom und einer gestörten Eisenaufnahme-fähigkeit über das Siderophor Mykobaktin einher. Es wird vermutet, dass die MAP spezifischen LSP14 und LSP15 zur Erhaltung der Metallhomöostase beitragen und eine Regulation der auf ihnen liegenden Gene durch metallabhängige Regulatoren der FUR-Familie (ferric uptake regulator) erfolgt. Bisher sind die Pathomechanismen von MAP weitgehend unbekannt. Zudem weiß man generell nur sehr wenig über den Metallstoffwechsel von MAP. Es wird jedoch immer deutlicher, dass die Metallhomöostase und die Fähigkeit von MAP zur Anpassung an das Wirtsmilieu maßgeblich für den Erfolg einer Infektion sind. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Bedeutung der zwei Transkriptionsregulatoren der FUR-Familie, FurA und FurB, von MAP für die Adaptation an das antimikrobielle Wirtsmilieu und für ihre Bedeutung für die Metallhomöostase untersucht.

FurA ist ein globaler Regulator der Eisenhomöostase und Stressantwort in vielen Bakterien. Die Rolle von FurA in Mykobakterien ist noch weitgehend ungeklärt, es wird jedoch eine Beteiligung an der Regulation der oxidativen Stressantwort vermutet. Ein direkter Nachweis hierfür und für seine konkrete Bedeutung für den Eisenhaushalt fehlte jedoch bisher. Transkriptom-Analysen einer MAP∆furA Deletionsmutante zeigten eine deutliche Divergenz im Regulationsmuster. Das FurA Regulon besteht aus reprimierten Genen, hauptsächlich der oxidativen Stressanwort, und aktivierten Genen, die mit intrazellulärem Überleben assoziiert sind. Bemerkenswert war, dass durch die furA Deletion kein Gen beeinflusst wurde, das mit Metallhomöostase in Zusammenhang steht. Eisenmangel- bzw. Peroxidexposition von MAP zeigten eine eisenabhängige Repressorfunktion von FurA, während die Aktivierung von Gentranskription wahrscheinlich durch das Apo-FurA vermittelt wird. Eine entscheidende Rolle von FurA für intrazelluläres Überleben wurde durch einen hyperresistenten Phänotyp der ∆furA Mutante im Makrophagen deutlich. Infektionsversuche mit Mäusen zeigten jedoch keinen sichtbaren Unterschied zwischen Wildtyp und Mutante, was darauf hindeutet, dass die prinzipielle Aufgabe von FurA die Regulation der oxidativen Stressantwort ist. Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen zum ersten Mal, dass FurA in Mykobakterien nicht an der Regulation der Eisenhomöostase beteiligt ist und geben Hinweis darauf, dass FurA als metallabhängiger Peroxidsensor für das intrazelluläre Überleben wichtig ist.

FurB ist ein wichtiger Regulator der Zinkhomöostase in Bakterien. Durch Zink- und Eisenmangelversuche konnte nachgewiesen werden, dass der IrtAB-ähnliche putative Eisentransporter mptABC, der auf dem LSP14 lokalisiert ist, zink- aber nicht eisenabhängig reguliert wird. Zudem konnte eine FurB-abhängige Regulation des mptABC Transporters mittels Reportergenstudien mit dem lacZ-Gen unter Kontrolle des Promotorbereichs von mptABC heterolog in M. smegmatis (MSMEG) sowie in einer MSMEG∆furB Deletionsmutante gezeigt werden. Des Weiteren konnte eine in Mykobakterien konservierte Bindestelle von FurB identifiziert werden. Transkriptomanalysen von Zinkmangelkulturen verdeutlichten die Relevanz von FurB für die Expression von LSP14 und LSP15 lokalisierten Genen. Von insgesamt 70 zinkabhängig regulierten Genen, inklusive MAP spezifischer zusätzlicher Zinkaufnahme-Systeme, lagen 45 Gene auf einem begrenzten Genomabschnitt von ca. 90 kb, der LSP14 and LSP15 beinhaltet. Auf dieser zinkabhängig regulierten genomischen Insel (ZnGI) kann für 35 dieser Gene eine FurB abhängige Expression auf Grund vorhandener putativer FurB Bindestellen angenommen werden. Die Häufung zinkabhängiger Gene auf einen bestimmten Genlokus wurde ausschließlich in MAP und nicht in anderen Mykobakterien gefunden.

Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen dieser Arbeit, dass FurA und FurB durch die Regulation wichtiger Adaptationsmechanismen zur Anpassung von MAP an das intrazelluläre Überleben in Wirtszellen beitragen. Die besondere Relevanz von Zink im Metabolismus von MAP wird durch einen einzigartigen Zinklokus im Genom unterstrichen und ist möglicherweise ein wichtiger Faktor für die besondere MAP Pathogenität.

abstract (englisch)

The pathogen Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) causes paratuberculosis in ruminants and is additionally discussed to be involved in the development of unclear immunological disorders in humans, such as Crohn's disease and diabetes type I, amongst others. In the host, MAP exhibits a unique gut tropism and is able to persist in the phagosome of macrophages. This tropism is associated with the presence of eight unique large sequence polymorphisms (LSPs) and an impaired synthesis of the siderophore mycobactin. The MAP specific LSP14 and LSP15 were supposed to be involved in metal homeostasis and a regulation of their genes by FUR-like proteins (ferric uptake regulator) was suggested.

To date, only few molecular pathomechanisms of MAP have been investigated and scarce information about the maintenance of metal homeostasis is available. However, it is getting more and more clear that the ability of MAP to adapt to the encountered host milieu and to counteract host cell defense mechanisms is most important for the outcome of infection.

Therefore, the presented study was aimed to analyse the relevance of the two FUR-like transcriptional regulators of MAP, namely FurA and FurB, in stress response and metal homeostasis.

In other bacteria, FurA is a global regulator of iron homeostasis and stress response. Even though FurA in mycobacteria was predicted to be involved in stress response, but evidence for this hypothesis is still missing. Transcriptome analysis of a furA deletion strain (MAP∆furA) revealed that the FurA regulon consists of repressed and activated genes associated to stress response or intracellular survival. Interestingly, not a single gene related to metal homeostasis was affected by furA deletion. Exposure of MAP to iron starvation or peroxide stress revealed that FurA repressor function is iron-dependent and gene activation seems to occur in its apoform. Furthermore, a decisive role of FurA in intracellular survival was indicated by a hyperresistant phenotype of MAP∆furA in macrophages. Nevertheless, no obvious effect could be observed in mouse experiments, indicating that the principal task of mycobacterial FurA is oxidative stress response regulation. These results demonstrate for the first time that mycobacterial FurA is not involved in the regulation of iron homeostasis, but provide clear evidence that FurA contributes to intracellular survival as a metal-dependent peroxide sensor.

Furthermore, this study indicated a particular relevance of zinc and FurB dependent gene expression for MAP. FurB is a major regulator of zinc homeostasis in bacteria. By zinc and iron depletion experiments, we found that a LSP14 located putative IrtAB-like iron transporter, encoded by mptABC, was induced by zinc but not by iron starvation. Moreover, heterologous reporter gene assays with the lacZ gene under control of the mptABC promoter in M. smegmatis (MSMEG) and in a MSMEG∆furB deletion mutant revealed a FurB mediated expression of mptABC via a conserved mycobacterial FurB recognition site. The impact of FurB in controlling gene expression of LSP14 and LSP15 became obvious after deep sequencing of RNA from MAP cultures treated with the zinc chelator TPEN. In total, 70 genes responded to zinc limitation, including two additional putative zinc uptake systems and a zinc scavenging zincophore, which seem to be unique for MAP. Remarkably, 45 of these genes were located on an approx. 90 kb large zinc responsive genomic island (ZnGI) which harboured LSP14 and LSP15. Thirty-five of these genes were predicted to be controlled by FurB, due to the presence of putative binding sites. This clustering of zinc responsive genes was exclusively found in MAP and not in other mycobacteria.

Overall, our data imply that FurA and FurB contribute to the adaptation of MAP to intracellular survival in host cells by regulating important adaptation mechanisms. This ability is particularly emphasised by the unique zinc specific locus in the MAP genome, thereby suggesting an exceptional relevance of zinc for the metabolism of MAP. MAP seems to be well adapted to maintain zinc homeostasis which might contribute to the peculiarity of MAP pathogenicity.

keywords

Zink Homöostase, Metalloregulatior, oxidativer Stress; zinc homeostasis, metalloregulator, oxidative stress

kb

2.981