Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Ann-Kathrin Diercks

 

Versuchstiersparende Qualitätskontrolle kryokonservierter Spermatozoen von Mausmutanten

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-100351

title (eng.)

Animal saving quality assessment of cryopreserved transgenic mouse spermatozoa

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2011

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/diercksa_ws11.pdf

abstract (deutsch)

Die Kryokonservierung von Spermatozoen ist eine etablierte Technik zur Sicherung transgener Mauslinien. Die Einstellung einer bestehenden Zucht dieser wertvollen Tiere kann jedoch nur nach einer erfolgreichen Qualitätskontrolle der kryokonservierten Proben aller Spendertiere verantwortet werden. Die bisher zu diesem Zweck angewendete in vitro-Fertilisation (IVF) mit nachfolgendem Embryotransfer ist nicht nur eine sehr zeit-, arbeits- und tierintensive Technik, sondern die Fertilität in der IVF wird von weiteren, von der Spermaqualität unabhängigen Faktoren beeinflusst. Somit kann im Falle einer negativen IVF nicht sicher auf eine schlechte Spermaqualität rückgeschlossen werden. Die getesteten Messungen der Motilität der Mausspermatozoen als Beurteilungsparameter zeigten jedoch keine gute Korrelation zur Fertilität in der IVF.

Mit der entwickelten Technik wird die Plasmamembranintegrität der Spermatozoen (% plasmamembranintakte Spermatozoen) fluoreszenzmikroskopisch ermittelt, welche mit der Fertilität in vitro korreliert und somit als alternative Qualitätskontrolle eingesetzt werden kann. Eine erfolgreiche Sicherung transgener Mauslinien über die Kryokonservierung nach der „neuen JAX-Methode“ von Spermatozoen ist gewährleistet, wenn die nachfolgenden Prozentsätze an Spermatozoen mit intakter Plasmamembran erreicht werden:

BL/6 ≥ 95% Spermien mit intakter Plasmamembran

FVB/N and NMRI ≥ 80% Spermien mit intakter Plasmamembran

Auf Grund eines möglichen Einflusses des Transgens selbst auf die Fertilität kann jedoch nicht vollständig auf die Durchführung einer IVF verzichtet werden. Die Durchführung einer IVF bleibt notwendig, um die generelle Eignung einer Mauslinie zur Kryokonservierung über Spermatozoen zu bestätigen Zudem ist es notwendig die Sicherung einer transgenen Linie über die Genotypisierung der geworfenen Jungtiere zu bestätigen.

Die optimale Qualitätssicherung besteht somit aus folgenden Schritten:

1) Re-Genotypisierung aller Spermatozoen-Spendertiere

2) ein bis zwei IVF mit nachfolgendem ET mit Genotypisierung der Jungtiere

3) fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der Plasmamembranintegrität aller Spendertiere

Mit der Untersuchung der Plasmamembranintegrität kryokonservierter Spermatozoen ist es somit möglich, 80 bis 90% der bisher benötigten Versuchstiere zur Qualitätssicherung einzusparen. Hiermit wird den Forderungen „reduction“ und „replacement“ der „3R“-Systematik nach RUSSELL und BURCH (1959) nachgekommen.

 

abstract (englisch)

Transgenic (tg) animals are unique mutants to study genes, their function, regulatory mechanisms, or (human) diseases. Cryopreservation of embryos or spermatozoa is a common approach to protect those lines against loss or to keep them in a repository. Only after cryopreservation of a sufficient number of samples of good quality a mutant line can be taken out of a breeding nucleus.

The quality of spermatozoa of different donors within a mouse line is heterogeneous. Technical problems in cryopreservation may also influence the success rate. Therefore, a significant quality assessment of the cryopreserved samples of each donor-animal is mandatory. Both, the cryopreservation itself and innovative quality assessment strategies lead to a reduction of the number of laboratory animals to be used.

To replace the common, but animal consuming in vitro-fertilization and the subsequently needed embryo transfer for quality assessment purposes of cryopreserved spermatozoa, a nearly animal free procedure was developed: A fluorescence microscopy based technique was established and validated. Concentrtion, motility, and membraneintegrity of spermatozoa were analyzed as parameters of major interest.

In vitro-fertilization with subsequend embryo transfer was performed in parallel with fluorescence-microscopic investigations using spermatozoa of the same cryopreserved sample. A total of 149 samples out of 38 transgenic lines of nine different genetic backgrounds were investigated.

Statistical analyses between IVF-results and fluorescence microscopy based investigation (sperm quality) indicated that the fertility of spermatozoa may be mainly influenced by the plasma membrane-integrity of spermatozoa.

The plasma membrane-integrity was found to be a reliable parameter to assess the quality of cryopreserved mouse spermatozoa. The percentage of spermatozoa with intact plasma membrane needed for a successful recovery of a transgenic line must be at least:

BL/6 ≥ 95% spermatozoa with intact plasma membrane

FVB/N and NMRI ≥ 80% spermatozoa with intact plasma membrane

Cryopreserved spermatozoa can be assessed by this technique thus replacing animal-consuming techniques as IVF and ET. Because of the possible influence of the transgen itself, one or two IVF with following ET and genotyping of the litter should be accomplished demonstrating the capacity to recover this line. Afterwards the quality control can be run by fluorescence microscopy. Overall 80 – 90% of animals needed for quality assessment purposes of cryopreserved spermatozoa can be saved. This contributes to the 3R principles (replacement, reduction, refinement) postulated by RUSSELL and BURCH (1959).

 

keywords

Kryokonservierung, Qualitätskontrolle, Transgene Mäuse, cryopresercation, quality assessment, transgenic mice

kb

2.379