Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Ann-Christin Diepers

Isolierung von Milchsäurebakterien mit hemmender Wirkung gegenüber Euterpathogenen und orientierende Untersuchungen zur intramammären Anwendung an der bovinen Milchdrüse

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110413

title (eng.)

Isolation of lactic acid bacteria with the ability to inhibit mastitis-causing pathogens and preliminary assessment of administration into the bovine mammary gland

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/diepersa_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Die bovine Mastitis, eine der einflussreichsten Erkrankungen der Milchkuh, liefert den häufigsten Grund für eine Therapie mittels antibiotischer Präparate. Um den Einsatz von Antibiotika in der Milchproduktion zu reduzieren, müssen alternative, nachhaltige Therapiemethoden gefunden werden. Milchsäurebakterien haben wachstumshemmende Eigenschaften gegenüber anderen Mikroorganismen und werden größtenteils als sichere, probiotische Bakterien eingestuft. Ziel dieser Arbeit war es, Milchsäurebakterien aufgrund ihrer antagonistischen und probiotischen Fähigkeiten auszuwählen, um zur Entwicklung eines alternativen Therapeutikums zur Behandlung boviner Mastitiden beizutragen.

Im ersten Teil der Arbeit wurden hierfür Milchsäurebakterien aus Milch-, Gras-, Gülle- und Einstreuproben aus dem bovinen Umfeld isoliert und auf ihre antagonistischen Fähigkeiten und probiotischen Eigenschaften untersucht. Die gewonnenen Isolate und Kombinationen mit Referenzstämmen wurden mittels Well-Diffusions-Test auf ihre wachstumshemmenden Fähigkeiten gegenüber sechs ausgewählten Euterpathogenen (Staphylococcus (S.) aureus ATCC 12600, S. epidermidis 575/07, S. xylosus 35/07, Streptococcus (Sc.) agalactiae ATCC 27956, Sc. uberis ATCC 700407, Escherichia (E.) coli DSM 4230) untersucht. Die Hälfte der untersuchten Milchsäurebakterienisolate konnte das Wachstum mindestens eines Indikatorkeims hemmen. Nach Neutralisierung des niedrigen pH-Wertes, der einen der Haupthemmmechanismen darstellt, waren noch ungefähr ein Viertel dieser Isolate in der Lage wachstumshemmend einzuwirken. Sc. uberis wurde am häufigsten gehemmt, gefolgt von S. epidermidis, S. aureus und S. xylosus. Nur eine Viererkombination aus zwei Wildstämmen (Lactobacillus (Lb.) plantarum 118/37 und Lb. paracasei 78/37) und zwei Referenzstämmen (Lactococcus (Lc.) lactis subsp. lactis ATCC11454 und Lb. rhamnosus ATCC7469) war in der Lage alle sechs Indikatorkeime in ihrem Wachstum zu hemmen. Bei hemmenden Milchsäurebakterienisolaten wurde eine biochemische und molekularbiologische Speziesbestimmung durchgeführt und ihre Resistenzeigenschaften geprüft. Zusätzlich wurde untersucht, ob sie im Hinblick auf eine Anwendung am Euter in der Lage sind an Zitzenkanalepithelzellen anzuheften und Milch als Substrat zu nutzen. Nach Einbeziehung aller funktionellen, technischen und sicherheitsrelevanten Kriterien wurde der Milchsäurebakterienstamm Lb. plantarum 118/37 für weitere Untersuchungen ausgewählt.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde, mit dem Ziel eine Applikationsform auf Basis lebender Mikroorganismen zu entwickeln, ein Gefriertrocknungsverfahren etabliert, welches eine stabile, langfriste Lagerung von Lb. plantarum 118/37 bei gleichzeitiger schneller Reaktivierungsmöglichkeit im Behandlungsfall ermöglicht. In anfänglichen Untersuchungen zur Gewebeverträglichkeit wurden 10 ml dieser Mikroorganismensuspension in den Konzentrationen 104 und 106 KbE (Kolonie‑bildende Einheiten) / ml in die bovine Milchdrüse verbracht. Keine Störungen des Allgemeinbefindens oder sichtbaren Beeinträchtigungen des Eutergewebes konnten festgestellt werden. Ein moderater Anstieg der somatischen Zellzahl in der Milch konnte in allen Eutervierteln ermittelt werden. Bei einer Dosierung von 106 KbE / ml kam es zu einer kurzzeitigen Sekretveränderung in Form von Flockenbildung. Lb. plantarum 118/37 konnte bis zu 36 h nach Applikation aus Milchproben isoliert und mittels RAPD-PCR im Milchsekret nachgewiesen werden.

Erste Untersuchungen zur Dosisdefinition wurden an drei weiteren, klinisch eutergesunden Kühen durchgeführt. Die gewählten Dosierungen waren 1,01 x 106, 2,0 x 106 und 3,0 x 106 KbE / ml Lb. plantarum 118/37. Unabhängig von der infundierten Menge der Milchsäurebakterien, waren keine Störungen des Allgemeinbefindens oder sichtbare Veränderungen des Eutergewebes feststellbar. Flockenbildung im Milchsekret wurde kurzzeitig bei der höchsten Dosierung in zwei Vierteln festgestellt. Die Behandlung mit der Lebendkultur verursachte in allen Vierteln einen signifikanten Zellzahlanstieg 12 h nach Applikation. Den schnellsten und kurzlebigsten Anstieg mit einem Höhepunkt nach 12 h war nach Applikation von 3,0 x 106 KbE / ml zu beobachten. Die Zellzahl stieg in allen Vierteln nach 1-3 Tagen wieder ab und war durchschnittlich geringer als am Anfang des Versuches. Dem Zellzahlanstieg lag eine Rekrutierung phagozytotischer Zellen zugrunde, vor allem polymorphkerniger, neutrophiler Granulozyten. Für eine Etablierung in der Milchdrüse gibt es keine Hinweise, da Lb. plantarum 118/37 unabhängig von der angewandten Dosierung nicht länger als 36 h im Milchsekret identifizierbar war.

Die Erkenntnisse dieser Arbeit liefern wichtige Informationen über die noch ungenutzten Fähigkeiten probiotischer Bakterien für die Anwendung in der bovinen Milchdrüse. Weitere Untersuchungen sind nötig, um optimale Behandlungsschemata festzulegen und die Wirksamkeit dieser Therapiemethode bei klinischen Mastitiden zu überprüfen. Nichtsdestotrotz werden wichtige Ansatzpunkte für eine alternative, nachhaltige Therapie boviner Mastitiden unter Sicherstellung von Tier- und Verbraucherschutz und eine Verminderung des Antibiotikaeinsatzes in der Milcherzeugung aufgezeigt.

abstract (englisch)

Bovine mastitis is one of the most influential infectious diseases of dairy cows and therefore one of the main reasons for antibiotic treatment in dairy industry. To reduce the use of antibiotics in milk production, alternative, sustainable treatment methods have to be sought. Lactic acid bacteria (LAB) show inhibiting activities against other microorganisms, are generally recognized as safe and may have curative capabilities.

The aim of this thesis was to isolate and select LAB strains according to their antagonistic and probiotic abilities and to develop a live culture treatment.

In a first investigation, LAB were isolated out of bovine environment (quarter foremilk samples, bulk milk, grass, manure and bedding materials). The obtained wild isolates and combinations with reference strains were screened with agar well diffusion assay for their ability to inhibit the growth of six indicator pathogens (Staphylococcus (S). aureus ATCC 12600, S. epidermidis 575/07, S. xylosus 35/07, Streptococcus (Sc.) agalactiae ATCC 27956, Sc. uberis ATCC 700407, Escherichia (E.) coli DSM 4230). More than half of these wild isolates were able to inhibit at least one indicator pathogen. After neutralization of the low pH-value, which presents one of the main inhibiting mechanisms of LAB, nearly one quarter of these isolates were still able to act growth retarding. Sc. uberis was the most inhibited indicator strain, followed by S. epidermidis, S. aureus and S. xylosus. Only the combination of two wild strains (Lactobacillus (Lb.). plantarum 118/37 und Lb. paracasei 78/37) and two reference strains (Lactococcus (Lc.) lactis subsp. lactis ATCC11454 und Lb. rhamnosus ATCC7469) inhibited all six pathogens. For further species determination, isolates with inhibiting properties were examined with biochemical and genetic identification assays and the presence of genes, related to antibiotic resistance was tested. Additionally, their adhesion capacity to bovine teat canal epithelial cells and their ability to use milk as a substrate were determined. Taking these functional, technical and security-related criteria into account, the long-term cultivable strain Lb. plantarum 118/37 was chosen for further investigations.

With the aim of developing a treatment based on a live culture, a freeze-drying protocol was established, which enables a durable storage with a quick reactivation possibility if treatment is required. A first assessment was conducted to evaluate tissue tolerability and immune response after an intramammary infusion of 10 mL Lb. plantarum 118/37 at a concentration of 104 and 106 cfu (colony forming units) / mL. No disturbance of general condition or visible impairment of udder tissue were detected. A slight increase in somatic cell count (SCC) were found in every treated quarter. The quarters treated with 106 cfu / mL show a temporary alteration of milk appearance.

For dose determination three doses of Lb. plantarum 118/37 (1.01 x 106, 2.0 x 106 and 3.0 x 106 cfu / mL) were inoculated into the mammary gland of three clinically healthy cows, one quarter was left as control. Independent of the infused LAB concentration, no signs of tissue disturbance or impairment of general condition were detected. Two quarters, which were treated with the highest LAB concentration, temporarily showed clots 12 h post infusion, which were disappeared by the next sampling. Infusion with a live culture leads to a rapid and considerable innate immune response. There was a significant increase in somatic cell count 12 h post infusion in every quarter regardless of treatment. The most rapid and short-lived increase, with its peak after 12 h, was observed after application of 3.0 x 106 cfu / mL. The SCC decreased after 1 – 3 days in every treated quarter and the average SCC was lower than at the beginning of the trial. The infusion of the live culture effects a recruitment of phagocytic cells, particularly neutrophils and macrophages. In the subsequent taken milk samples Lb. plantarum 118/37 was isolated and identified with RAPD-PCR method but was no longer detectable in any of the treated udder quarters after 36 h.

The findings of this study deliver important information about the unused abilities of probiotic bacteria and their possible application into the bovine mammary gland. Further investigations are necessary to determine an optimal treatment scheme and proof the efficacy of this treatment method for clinical mastitis cases. Nevertheless, the results of this investigation provide important starting points for an alternative, sustainable therapy of bovine mastitis under the aspects of animal welfare and consumer protection and a reduction of the antibiotic use in milk production.

keywords

Milchsäurebakterien, bovine Mastitis, probiotische Eigenschaften ; Lactic acid bacteria, bovine mastitis, probiotic properties

kb

966