Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Lena Diekmann, M.Sc.

 

The concerted action of multiple post-translational events regulates the trafficking and function of wild type and mutant disaccharidases

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107930

title (ger.)

Das Zusammenspiel von verschiedenen post-translationalen Ereignissen reguliert den Transport und die Funktion von Wildtyp und Mutanten Disaccharidasen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/diekmannl_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Laktose ist das häufigste Kohlenhydrat in der Milch von Säugetieren. Für die Aufnahme in das Zellinnere ist eine vorherige Hydrolyse von Laktose in die Monosaccharide Glukose und Galaktose notwendig, welche durch das Enzym Laktase-Phlorizin Hydrolase (LPH) katalysiert wird. LPH ist die einzige β-Galaktosidase der Bürstensaummembran im Dünndarm und gehört zur Proteinklasse der membranständigen Glykoproteine. Während des Transports entlang des sekretorischen Weges innerhalb der Zelle wird LPH post-translational durch N- und O-Glykosylierung, Dimerisierung und proteolytische Spaltungsprozesse modifiziert.

Defekte im intestinalen Laktoseverdau, die durch unzureichende Laktase-Aktivität ausgelöst werden, führen zu gastrointestinalen Symptomen, welche charakteristisch für eine Lactoseintoleranz sind. Kongenitale Laktase Defizienz (KLD) ist die schwerwiegendste Form von Laktoseintoleranz und wird durch Mutationen in der kodierenden Sequenz des LPH Gens ausgelöst.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden zwei neue Mutationen im Gen von LPH untersucht, welche in einem kombinierten heterozygoten Vererbungsmuster bei einem japanischen Säugling entdeckt wurden. Der Einfluss von beiden Mutationen, Y1473X und D1796fs, auf die Struktur, die Biosynthese und die Funktion von LPH wurde mittels transienter Expression in COS-1 Zellen analysiert. Beide mutierten Proteine sind mannosereich N-glykosyliert, falsch gefaltet, enzymatisch inaktiv und werden im endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten. Interessanterweise interagiert keines der mutierten Proteine mit dem Wildtyp-Protein. Daher kommt es nicht zur Bildung von Heterodimeren. Daraus lässt sich schließen, dass die Transmembrandomäne, welche bei beiden Mutanten fehlt, eine notwendige Voraussetzung für die Heterodimerisierung von LPH-Proteinen im ER darstellen könnte.

Im zweiten Teil der These wurden die strukturellen Determinanten, die für den Transport und die Reifung von LPH entlang des sekretorischen Weges in der Zelle wichtig sind, detaillierter untersucht. Durch Deletionsmutanten konnte gezeigt werden, dass die Stretchregion in Domäne II der Ektodomäne ein wichtiges Strukturelement darstellt. Eine mögliche Interaktion mit dem ER-ständigen Chaperon Calnexin (CXN) durch die N-Glykosylierungssequenz in exakt dieser Stretchregion konnte durch ein Co-Immunpräzipitationsexperiment (IP) bewiesen werden. Die eingesetzten Konstrukte, welche die Stretchregion in Domäne II enthalten, zeigten eine verstärkte Interaktion mit Calnexin (CXN). Mit Hilfe dieser verschiedenen Konstrukte konnte des Weiteren gezeigt werden, dass Domäne I und III der Ektodomäne von LPH als intramolekulare Chaperone dienen, während Domäne II und IV keine essentielle Rolle für die Transportkompetenz aufweisen.

Die vorliegende Arbeit bietet fundamentale Einblicke in die Pathophysiologie von Mutationen im Gen von LPH, die KLD verursachen und komplementiert das Wissen über strukturelle Determinanten, die wichtig sind für post-translationale Ereignisse des Multidomänen-Glykoproteins LPH.

abstract (englisch)

Lactose is the main carbohydrate of mammalian milk. For its uptake into the cell previous hydrolysis into the monosaccharides glucose and galactose is required, which is mediated by lactase-phlorizin hydrolase (LPH). LPH, the only β-galactosidase of the brush border membrane in the small intestine, is a membrane glycoprotein, which is post-translationally modified along the secretory pathway by N- and O-glycosylation, dimerization and proteolytic cleavage steps.

Defects of intestinal lactose digestion due to insufficient lactase activity result in gastrointestinal symptoms characteristic for lactose intolerance. Congenital lactase deficiency (CLD) is the severe form of lactose intolerance, which is caused by mutations in the coding region of the LPH gene.

The first part of this thesis investigated two novel mutations in the gene of LPH, which were detected in a Japanese infant in a compound heterozygous inheritance pattern. The influence of both mutations, Y1473X and D1796fs, on the structure, biosynthesis and function of LPH was assessed by transient expression in COS-1 cells. Both mutants are mannose-rich N-glycosylated, misfolded and enzymatically inactive proteins, which are retained in the endoplasmic reticulum (ER). Interestingly, none of those anchorless pathogenic mutant forms undergo heterodimer formation with the wild type, concluding that the transmembrane domain might be one requirement for heterodimerization of LPH.

The second part of this thesis elucidated structural determinants of the multi-domain membrane glycoprotein LPH for its transport and maturation along the secretory pathway. By utilizing deletion variants, the role of the stretch region in domain II of the ectodomain was determined as an important structural element. A possible interaction of a potential N-glycosylation site in this stretch region with the ER-resident chaperone calnexin (CNX) was confirmed by co-immunoprecipitation. The constructs containing the stretch in domain II show an increased interaction with CNX. The biochemical analyses of those constructs offered that domain I and III of the ectodomain of LPH act as intramolecular chaperones, while domain II and IV are not essential for transport competence.

Taken together, the present thesis provides insights into the pathophysiology of CLD causing LPH mutations and complements the knowledge of the structural determinants for post-translational events of the multi-domain glycoprotein LPH.

keywords

lactase-phlorizin hydrolase, congenital lactase deficiency, posttranslational modifications/Laktase-Phlorizin Hydrolase, Kongenitale Laktase Defizienz, posttranslationale Modifikationen 

kb

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