Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Nicole de Buhr

Interaction of Streptococcus suis with neutrophil extracellular traps (NETs)

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107168

title (ger.)

Interaktion von Streptococcus suis mit neutrophilen extrazellulären Netzen (NETs)

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/debuhrn_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Streptococcus (S.) suis führt als Infektionserreger beim Schwein und Menschen zu eitrigen Meningitiden, die mit einer Pleozytose im Liquor cerebrospinalis (CSF) einhergehen. In neutrophilen Granulozyten wurde kürzlich ein grundlegender Abwehrmechanismus des angeboren Immunsystems gegen verschiedene Pathogene entdeckt: die Formation von neutrophilen extrazellulären Netzen (NETs). NETs werden von Neutrophilen durch den Ausstoß von DNA in Kombination mit antimikrobiellen Molekülen gebildet und sind in der Lage Erreger zu binden, zu entschärfen und zu töten. Verschiedene Erreger besitzen NETs Evasionsfaktoren wie DNasen. NETs spielen vermutlich auch in verschiedenen Erkrankungen eine Rolle und die Mechanismen welche zur Freisetzung von NETs führen sind bisher nur schlecht verstanden.

In dieser Studie wurde die Interaktion von S. suis und NETs mit unterschiedlichen, vor allem immunfluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei wurde insbesondere die Rolle und Bedeutung von zwei DNasen beleuchtet. Durch eine phänotypische Analyse entsprechender in frame Deletionsmutanten und des Wildtyps konnten wichtige Phänotypen in der Erreger-Wirt Interaktion charakterisiert werden. Im ersten Teil dieser These [Kapitel 3.1] konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass S. suis NETs induziert, in ihnen eingefangen wird und diese NETs degradiert. Die sekretierte Nuklease A (SsnA) ist an der NETs Degradation beteiligt ist und schützt S. suis gegen antimikrobielle Aktivitäten der NETs. Der zweite Teil der Arbeit [Kapitel 3.2] beinhaltet die Identifikation einer neuen Endonuklease A von S. suis (EndAsuis), die an der NETs Degradation währende der exponentiellen Wachstumsphase beteiligt ist. EndAsuis benötigt Mg2+ für die Aktivität wohingegen SsnA Mg2+ und Ca2+ benötigt. Im dritten Teil der Arbeit [Kapitel 3.3] wurde die Formation von NETs im S. suis-infizierten CSF untersucht. In einem inversen Transwell Modell folgten humane neutrophile Granulozyten S. suis durch ein Epithel von Choroid Plexus Papilloma Zellen in ein unteres Kompartiment, das dem CSF-Raum entspricht. In diesem Kompartiment konnten NETs mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und der Bestimmung von dsDNA nachgewiesen werden. Ferner gelang der Nachweis, dass diese NETs S. suis einfangen. Die Anzahl der detektierbaren Netze und das bakterielle Überleben waren unabhängig von der Expression der bakteriellen Nukleasen SsnA und EndAsuis. Die beobachtete Induktion des NETs schützenden Faktors LL-37 könnte dieses Ergebnis erklären. Diese in vitro Ergebnisse werden durch die Detektion von NETs in CSF Proben von S. suis infizierten Tieren untermauert. Insgesamt sprechen die Ergebnisse für eine Bedeutung der Bildung und Degradation von NETs in der Pathogenese der S. suis Meningitis.

abstract (englisch)

Streptococcus (S.) suis causes as infectious agent suppurative meningitis in humans and piglets, which is characterized by a pleocytosis in the cerebrospinal fluid (CSF). In neutrophils, a novel fundamental innate immune defense mechanism against different pathogens has been identified: the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs are formed by neutrophils following extracellular ejection of DNA in combination with antimicrobial molecules and bind, disarm and kill pathogens. Different pathogens express NET evasion factors like DNases. NETs might play different roles in diseases and the mechanisms leading to NET release are only poorly understood.

In this study, the interaction of S. suis and NETs was investigated using immunofluorescence microscopy. Especially the function of two DNases was investigated. Phenotypic analysis was conducted using in frame deletion mutants, which were investigated comparatively to the wildtype under various conditions. Important phenotypes in the pathogen-host interaction were identified. In the first part of this thesis [Chapter 3.1] it was demonstrated for the first time that S. suis induces NETs, is entrapped in NETs and degrades NETs. Furthermore, this work revealed that the known secreted nuclease A (SsnA) is involved in NET degradation and that this nuclease protects S. suis against the antimicrobial activity of NETs. The second part [Chapter 3.2] includes the identification of a novel endonuclease A of S. suis (EndAsuis), which is involved in NET degradation during the exponential growth phase. EndAsuis was shown to require Mg2+ for activity whereas SsnA needed Mg2+ and Ca2+.

In the third part [Chapter 3.3] NET formation in the S. suis-infected CSF compartment was examined. In an inverse transwell model, human neutrophils followed S. suis by transmigration through the epithelium formed by choroid plexus papilloma cells in the lower compartment, which represents the CSF-compartment. Importantly, NETs were detected in the CSF compartment by immunofluorescence microscopy and biochemical determination of dsDNA. Furthermore, it was visualized that streptococci were entrapped in NETs. However, the number of detectable NETs and the bacterial survival did not depend on the expression of the bacterial nucleases SsnA and EndAsuis. The detected induction of the NET protecting factor LL-37 might explain this result. These in vitro results were corroborated by the detection of NETs in CSF samples of S. suis infected piglets.

In conclusion, the results suggest that NET formation and degradation might play a role in the pathogenesis of  S. suis meningitis.

keywords

Meningitis, Nukleasen, Zoonose; meningitis, nucleases, zoonosis

kb

4.221