Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Franziska Dahlmann

Analyse des Eintritts von Ebolaviren in Makrophagen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104609

title (engl.)

Analysis of ebolavirus entry into macrophages 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/dahlmannf_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Das Ebola hämorrhagische Fieber (EHF) ist eine zoonotische Erkrankung, die mit fatalen Verläufen in Menschen und Primaten einhergeht. Ursächlich sind Viren des Genus Ebolavirus aus der Familie Filoviridae - membranumhüllte RNA-Viren, die aufgrund ihrer extremen Virulenz nur in Laboratorien der höchsten Sicherheitsstufe, S4, untersucht werden können. Gegenwärtig stehen weder Impfstoffe noch Therapeutika zur Verfügung, die vor EHF schützen. Für die Entwicklung antiviraler Ansätze ist ein genaues Verständnis der Virus-Wirtszellinteraktionen wichtig. Das virale Glykoprotein (GP) vermittelt den ersten Schritt im Ebolavirus-Vermehrungszyklus, den Virus-Eintritt in Zielzellen. In den letzten Jahren wurden mehrere zellulären Faktoren beschrieben, die den Eintritt von Ebolaviren in Zelllinien fördern: Lektine, Proteine der TIM-Familie, TAM Rezeptor-Tyrosinkinasen (Axl, Mer, Tyro3) sowie der Cholesteroltransporter NPC1. Dabei ist bemerkenswert, dass sowohl TIM-Proteine als auch TAM Rezeptor-Tyrosinkinasen an der Phagozytose apoptotischer Zellen beteiligt sind und es Hinweise darauf gibt, dass das Ebolavirus den zugrundeliegenden Mechanismus für seine Aufnahme in Zelllinien nutzt. Welche zellulären Faktoren und Prozesse den Eintritt in Makrophagen fördern, die die wichtigsten Zielzellen des Ebolavirus darstellen, ist dagegen weitgehend unklar und sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht werden. Mit Hilfe von lentiviralen Vektoren, die das Ebolavirus Glykoprotein (GP) auf ihrer Oberfläche tragen, konnte gezeigt werden, dass Mannose-spezifische Lektine sowie TIM-1 den GP-vermittelten Eintritt in transfizierte Zelllinien deutlich steigern können. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass endogen exprimiertes Axl und TIM-1 den GP-getriebenen Eintritt in einer zelltypabhängigen Weise steigern. Expressionsanalysen sowie Experimente mit siRNAs und anderen Inhibitoren demonstrierten jedoch, dass diese Faktoren für den GP-vermittelte Eintritt in Makrophagen nicht wichtig sind. Im Gegensatz dazu war die Expression von NPC1 für den effizienten GP-getriebenen Eintritt in Zelllinien und Makrophagen essentiell. TIM-1 und Axl sind für die Phagozytose von apoptotischen Zellen wichtig. Daher wurde untersucht, ob Faktoren die auf Makrophagen exprimiert werden und an der Erkennung und Aufnahme von apoptotischen Zellen beteiligt sind, durch das Ebolavirus für den Zelleintritt verwendet werden. Der Einsatz von siRNAs und anderen Inhibitoren zeigte, dass Mer, Integrin αV und scavenger receptor A (SR-A) für die GP-getriebene Infektion von Makrophagen wichtig sind, allerdings konnte eine unspezifische Wirkung der gegen SR-A gerichteten siRNA nicht ausgeschlossen werden. Schließlich konnte demonstriert werden, dass siRNAs gegen SR-A, Mer, Integrin αV und NPC1 die Infektion von Makrophagen durch vermehrungsfähiges Ebolavirus reduzieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Ebolavirus mehrere Wirtszellproteine für den Eintritt in Makrophagen nutzt, die für die Aufnahme apoptotischer Zellen wichtig sind. Weitere Studien müssen zeigen, ob diese Faktoren Ansatzpunkte für die antivirale Intervention darstellen.

abstract (englisch)

Ebola hemorrhagic fever is a zoonotic viral disease, which is associated with high case fatality rates in humans and primates. The causative agents, ebolaviruses, are enveloped RNA viruses which belong to the family filoviridae and, because of their extreme virulence, require handling under biosafety level 4 conditions. At present, neither vaccines nor therapeutics are available to protect against infection by ebolaviruses. For development of antiviral strategies, it is necessary to elucidate virus-host cell interactions. The viral glycoprotein (GP) mediates the first step in the viral replication cycle, the infectious entry into host cells. Recently, several cellular factors have been found to promote the entry of ebolaviruses into cell lines: Lectins, TIM proteins, TAM (Tyro3, Axl, Mer) receptor tyrosine kinases and the cholesterol transporter NPC1. Interestingly, both TIM family members and TAM receptor tyrosine kinases are involved in the phagocytosis of apoptotic cells, indicating that ebolaviruses might exploit cellular processes involved in the clearance of apoptotic cells to enter host cells. However, the cellular entry of ebolaviruses has so far mainly been studied with cell lines and it is largely unknown how ebolaviruses enter macrophages, which constitute the major viral target cells. Therefore, the aim of the present study was to identify host cell factors which promote entry of ebolaviruses into macrophages. For analysis of ebolavirus entry, lentiviral pseudotypes bearing the Zaire ebolavirus glycoprotein (EBOV-GP) were employed. Several mannose-specific lectins and TIM-1 were shown to promote entry into transfected cells. Furthermore, expression of endogenous Axl and TIM-1 was demonstrated to promote GP-driven entry in a cell-line dependent manner. However, expression studies combined with inhibition analyses demonstrated that neither mannose-specific lectins nor TIM-1 or Axl contribute to GP-mediated entry into macrophages. In contrast, NPC1 expression was essential for efficient GP-mediated entry into cell lines and macrophages. TIM-1 and Axl are important for recognition of apoptotic cells. Therefore, it was determined whether other factors involved in recognition of apoptotic cells by macrophages might be required for GP-dependent entry into this cell type. Inhibition studies with siRNAs and other inhibitors revealed that Mer, integrin αV and scavenger receptor A (SR-A) contribute to GP-mediated entry into macrophages, although unspecific effects of the SR-A siRNA could not be excluded. Finally, it was demonstrated that siRNAs against SR-A, Mer, integrin αV and NPC1 reduced macrophage infection by replication competent Zaire ebolavirus. These results show that ebolaviruses engage multiple host cell proteins for entry into macrophages, which are involved in the phagocytosis of apoptotic cells. Further studies are required to analyze whether these factors represent targets for antiviral intervention.

keywords

Ebolavirus, Makrophagen, Eintritt; ebolavirus, macrophages, entry

kb

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