Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Sucheera Chotikatum

The effect of cytokines and involvement of ER stress on intestinal epithelial cell polarity, protein folding and expression of intestinal proteins

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110398

titel (deu.)

Der Einfluss von Zytokinen und ER-Stress auf die Polarität intestinaler Zellen, sowie auf die Faltung und Expression intestinaler Proteine

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/chotikatums_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen, wie Morbus Chron und Colitis ulcerosa, sind verbunden mit überschießender Immunantwort des Körpers und Beeinflussung der Barrierefunktion des intestinalen Epithels. Dies führt wiederum zu erhöhtem Flüssigkeitsverlust durch Diarrhoe. Proteine, die in der Erhaltung der intestinalen Zellpolarität und dem Schutz der Barrierefunktion beteiligt sind werden im Endoplasmatischen Retikulum (ER) der Darmzellen prozessiert. Das ER übernimmt eine wichtige Rolle in der Synthese, der Faltung und der Sortierung von Proteinen zur apikalen oder basolateralen Zelloberfläche.

Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen können eine erhöhte Konzentration von proinflammatorischen Zytokinen in der intestinalen Mukosa aufweisen. Die Zytokine lösen eine Entzündungsreaktion aus, welche im Folgenden die Faltung von Proteinen im ER beeinflussen kann. Dadurch sammeln sich ungefaltete Proteine vermehrt im ER und lösen, in Folge des ER-Stress, eine ungefaltete Proteinantwort (engl. unfolded protein response, UPR) aus. Dies kann zu veränderter Lokalisierung und damit verbundener Fehlfunktion von Zelloberflächenproteinen der intestinalen Epithelzellen führen.

Das Ziel dieser Studie war es, die Verbindung zwischen Zytokin induzierter Entzündung im Darm, ER-Stress und der Zellpolarität sowie der Proteinfaltung und –lokalisierung im Caco-2 Zellmodell genauer zu erforschen. Die Induktion von ER-Stress wurde durch eine Inkubation von 7 Tage post-konfluenten Caco-2 Zellen mit einer Mischung von Zytokinen (TNF-α, IL-1β, MCP1) für 8 und 24 Stunden vorgenommen. Durch Messung des Proteinlevels von Chaperonen in den behandelten Caco-2 Zellen, wurde das Auslösen von ER-Stress überprüft. Dabei zeigte sich, dass die Proteinexpression der Chaperone und ER-Stressmarker BiP und CHOP in Zytokin behandelten (8 und 24 Stunden) Caco-2 Zellen signifikant erhöht war. Darüber hinaus zeigte sich eine deutliche Abnahme des transepithelialen elektrischen Wiederstands (engl. transepithelial electrical resistance, TEER) nach Zytokin Behandlung der Zellen. Das Ergebnis spricht für eine beeinflusste Integrität und somit verschlechterte Barrierefunktion des Epithels. Zusätzlich wurde der Einfluss von Zytokinbehandlung der Caco-2 Zellen auf die katalytische Kapazität sowie die Sortierung und Aktivität der Saccharase-Isomaltase (SI) untersucht. Die SI ist ein häufiges Protein der Bürstensaummembran intestinaler Epithelzellen, mit Wichtigkeit in der Kohlenhydratverdauung. Sowohl die katalytische Kapazität als auch die Sortierung und Aktivität der SI waren nach Cytokinbehandlung im Vergleich zu unbehandelten Caco-2 Zellen verändert. Die Untersuchung von DPPIV, eines weiteren Zelloberflächenproteins von Darmzellen, lieferte ähnliche Ergebnisse. Des Weiteren führte der Zytokin induzierte ER Stress zu einer verringerten Expression von Strukturproteinen, wie Ezrin und ZO-1, innerhalb der Caco-2 Zellen.

Es lässt sich schlussfolgern, dass eine Zytokinbehandlung zu einer veränderten Sortierung verschiedener Proteine innerhalb intestinalen Epithelzellen führt, möglicherweise basierend auf  veränderter Proteinglykosylierung.

Hypoxie, ein Zustand von Sauerstoffmangel während Infektionen oder Entzündungsreaktionen im Körper, wird zusätzlich mit der Pathogenese von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen in Verbindung gebracht. Auch eine mögliche Verbindung von Hypoxie mit ER-stress ist nicht ausgeschlossen/wird vermutet. In einem weiteren Teil der Studie, wurde der Einfluss von Hypoxie-induziertem ER-Stress auf die Barrierefunktion des Caco-2 Zellmodells untersucht. Für diese Untersuchung wurden 7 Tage post-konfluente Caco-2 Zellen für 24, 48 und 72 Stunden bei Normoxie oder Hypoxie inkubiert. Nach 48 und 72 Stunden Inkubationen der Zellen unter Hypoxie zeigte sich eine signifikant erhöhte Expression von BiP und CHOP. Darüber hinaus war ein Abfall des transepithelialen elektrischen Wiederstands nach 48 Stunden und 72 Stunden nach Inkubation der Zellen unter Hypoxie zu vermerken. Diese Ergebnisse bestätigen, dass Hypoxie ER-Stress im Caco-2 Zellmodell auslösen kann.

abstract (englisch)

Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease or ulcerative colitis are characterized by exaggerated inflammatory responses and are aggravated by the epithelial barrier dysfunction that results from the increased loss of fluid due to diarrhea. The proteins involved in the maintenance of epithelial cell polarity and protection of the barrier integrity are processed by the endoplasmic reticulum (ER) that has a crucial role in the synthesis, correct folding, proper sorting and trafficking to either the apical or basolateral membrane in polarized epithelial cells. Pro-inflammatory cytokines are elevated in the intestinal mucosa of patients with IBD, and they have been shown to further trigger inflammation and lead to altered protein folding, causing accumulation of unfolded proteins in the ER ultimately resulting in aberrant localization of specific cell surface proteins and their improper functioning. This study aims to investigate the link between cytokine-induced inflammation, ER malfunction and the consequences of the ER stress response on the intestinal epithelial cell polarity, protein folding and expression of intestinal proteins. Therefore, a mixture consisting of the cytokines TNF-α, Il-1β­, and MCP1, was used to induce ER stress in Caco-2 cells at 8 and 24 hour at 7 day post- confluency, when these cells very closely mimic in vivo epithelial cells of the small intestine. ER stress induction in Caco-2 cells was confirmed by measuring the levels of chaperone proteins, BiP and CHOP, that act as stress markers and that were significantly increased at 8 and 24 hour after the cytokine treatment. Moreover, transepithelial electrical resistance (TEER) showed a marked decrease after treatment, indicating the epithelial barrier integrity is affected. Furthermore, the catalytic capacity, sorting and activity of sucrase-isomaltase, a major glycoprotein of the intestinal brush border membrane, were significantly decreased after cytokine treatment. We saw a similar reduction for the enzyme dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) after treatment. Moreover, cytokine-induced ER stress results in a reduction in the level of the structural component proteins ezrin and ZO-1, at the apical and basolateral membranes respectively. Taken together, the results of our study indicate that aberrant processing in the ER, most likely glycosylation, after cytokine treatment, may lead to improper trafficking of enzymes and intestinal proteins to their target location on the apical and basolateral membranes. Futhermore, hypoxia, a condition of oxygen deficiency that occurs during infections or inflammations and has been shown to influence the pathogenesis of IBD, was able to induce ER stress in our model, as evidenced by the increase in BiP and CHOP levels. Hypoxic incubation also lead to a significant decrease in TEER, indicating damage to the epithelial barrier.

Overall, this study shows that perturbations to the ER environment, whether chemical or physical, can cause stress and induce a series of mechanisms and cellular adaptions that work to compensate for this stress and at the same time lighten the work load and provide relief to the ER until such a time when homeostasis is returned. These cellular adaptations include decrease in protein modification in the ER, which results in lowered or improper membrane localization. Furthermore, defects to the junctional complexes weaken the epithelial barrier, and that, in combination with the loss of polarization, lead to severe and pathogenic consequences to the intestinal epithelium.

keywords

ER-Stress, Zytokinen, Intestinalen Epithels Zellen ; ER-Stress, Cytokines, Intestinal epithelial cell

kb

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