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abstract (deutsch)
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Im Rahmen der vorliegenden PhD-These
wurde das Potential transplantierter adulter
humaner Schwann-Zellen (ahSZ)
und adulter Ratten-Schwann-Zellen
(arSZ) zur Verbesserung der peripheren
Nervenregeneration über große Nervenlücken untersucht. Dabei wurde das Schwann-Zell-Schicksal und die Funktion der Schwann-Zellen in einem Rattenmodel mit Rekonstruktion
des Nervus ischiadicus untersucht. Primäre ahSZ und arSZ wurden isoliert,
in vitro angereichert und vermehrt. Die nicht-virale Transfektion adulter Schwann-Zellen mittels
der “Nucleofection” Technik (Amaxa) wurde mit dem Endziel der Induktion der
Überexpression von Fibroblasten-Wachstums-Faktor-2 (FGF-2) etabliert. Die
Nutzung des “primary endothelial
cell nucleofection kit” in Kombination mit dem Nuclefection-Programm
T-30 (Amaxa-Gerät II) bewies sich als am besten
geeignet um optimale Überlebens- und Transfektionraten
in sowohl ahSZ als auch arSZ
zu erzielen. Adulte Schwann-Zellen
sollten nach ihrer Transplantation in periphere Nervenlücken (10 mm), die mit
Silikonröhrchen überbrückt wurden, identifiziert und lokalisiert werden.
Deshalb wurden diese Zellen vor der Transplantation mit einem fluoreszierenden Zelllinker (PKH26-GL) an ihrer Oberfläche
markiert. Schicksal und Überleben naiver ahSZ und arSZ wurden 2, 4 und 6 Wochen nach ihrer Transplantation
in Nervus ischiadicus-Lücken adulter
Ratten evaluiert. Nach Ende der Beobachtungsräume wurden an
Längs-Gefrierschnitten durch das regenerierte Nervengewebe immunhistologische
Techniken angewandt um regenerierende Nervenfasern (Growth associated protein-43, GAP-43), Myelin
(Protein Zero) und Myelin menschlichen Ursprungs (Peripheral Myelin Protein-22,
PMP-22) sowie eingewanderte Makrophagen (ED-1
Oberflächen-Molekül) detektieren zu können. Die Ergebnisse
zeigten, dass ahSZ und arSZ
nach PKH-26GL-Markierung eine Transplantation überlebten
und bis zu 6 Wochen später lokalisiert werden können. Außerdem zeigten die zuvor
markierten ahSZ 6 Wochen nach Transplantation (1)
eine heterogene Verteilung und eine enge Assoziation mit regenerierenden Axonen (anti-GAP-43-Markierung) und (2) eine bevorzugte
periphere Lokalisation in der regenerierten Gewebebrücke. Eine Beteiligung
transplantierter ahSZ an der Myelinisierung
regenerierter Axone konnte aber nicht nachgewiesen
werden (anti-PMP-22-Markierung. Zur Evaluation der Effekte der
Transplantation von ahSZ auf die Regeneration
peripherer Nervenlücken, wurde dies Maßnahme mit der zellfreien
Rekonstruktion der Nervenlücken verglichen (n = 5 Tiere, 3 und 7 Wochen nach
Transplantation). Das regenerierte periphere Nervengewebe wurde nach einer Myelinfärbung in Epon
eingebettet und semidünne (1 µm) und ultradünne (50 nm) Querschnitte morphometrisch analysiert. Die Transplantation von ahSZ erhöhte gegenüber der zellfreien
Nervenrekonstruktion signifikant die Wiederherstellung der Gewebekontinuität.
Die morphometrische Analyse zeigte: (1) Größere
Querschnittsflächen des regenerierten Gewebes, (2) eine größere Anzahl
regenerierter myelinisierter Axone,
(3) höhere Nervendichten und (4) einen höhere Vaskularisierungsgrad
in der Mitte der regenerierten Gewebebrücken nach Transplantation von ahSZ. Die ultrastrukturelle Analyse zeigte sowohl reguläre
als irreguläre Myelinformierung und die Anwesenheit
weniger eingewanderter Makrophagen, welche mit den
oben erwähnten immunhistologischen Methoden nicht detektiert wurden. In einem
ersten Versuch ahSZ zu transplantieren, die FGF-2 überexprimieren, wurde in diesen Zellen mittels Nucleofection die Überexpression von mit Flag-verknüpften FGF-218kD induziert. Die Zellen wurden
dann in mit Silikonröhrchen rekonstruierte 10 mm große Nervenlücken der Ratte
transplantiert. Drei und 7 Wochen später war in allen Tieren (n = 3 pro
Zeitpunkt) die Kontinuität der Nerven wiederhergestellt. Das Gewebe muss
zukünftig auf die Anwesenheit von FGF-218kD-flag exprimierenden
ahSZ untersucht werden. Dennoch weist die
erfolgreiche Gewebewiederherstellung darauf hin, dass die transfizierten
ahSC die Transplantation überlebten und den
Regenerationsprozess unterstützt haben. Die vorliegende Studie trägt zu einem
besseren Verständnis zellulärer Prozesse nach Transplantation on ahSZ in periphere Nervenlücken bei, was von klinischem
Interesse ist. Darüber hinaus wurde zum ersten Mal ein Protokoll zur
Anwendung der Nucelofection zur nicht-viralen
Transfektion von ahSZ
etabliert. Dieses eröffnet den Weg für die ex vivo-Gentherapie
als Maßnahme in der Rekonstruktion menschlicher peripherer Nerven.
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abstract (englisch)
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Within
the current PhD-Thesis, the potential of transplanted adult human Schwann
cells (ahSC) and adult rat Schwann cells (arSC) to improve peripheral nerve regeneration across long
gaps was investigated and analyzed regarding cell fate and function in an
adult rat model of sciatic nerve repair. Primary ahSC
and arSC were isolated, enriched and proliferated
in vitro. Non-viral transfection of adult Schwann
cells by the nucleofection technique (Amaxa) was established to finally induce over-expression
of fibroblast growth factor-2 (FGF-2). The use of primary endothelial cell nucleofection kit in combination with the T-30 nucleofection program (Amaxa
device II) proved to result in optimal survival and transfection
rates, both for ahSC and arSC.
To identify and localize adult Schwann cells after
transplantation into peripheral nerve gaps (10 mm) bridged by silicone tubes,
the cells were prior to transplantation labeled
using a fluorescent linker (PKH26-GL). Fate and survival of naïve ahSC and arSC were analyzed 2,
4, and 6 weeks after transplantation into adult rat sciatic nerve gaps. After
the end of the observation periods, longitudinal frozen sections of the
regenerated nerve tissue were analyzed using immunohistological
techniques to detect regenerating nerve fibers
(Growth Associated Protein-43, GAP-43), myelin (Protein Zero), human-specific
myelin (Peripheral Myelin Protein-22, PMP-22) and macrophages (surface
protein, ED-1). The results demonstrate that ahSC
and arSC survive and can be localized by their
PKH26-GL pre-labeling up to 6 weeks after
transplantation. Additionally, pre-labeled ahSC displayed: (1) heterogeneous distribution and close
association with regenerating axons (anti-GAP-43 staining), 6 weeks post
surgery, (2) a preferential peripheral localization in the longitudinal
section of regenerated tissue cable. However, a contribution of transplanted ahSC to the myelination of
regenerated axons could not be demonstrated (anti-PMP-22 staining).
To detect effects of ahSC transplantation on
peripheral nerve regeneration across nerve gaps, this attempt was compared to
acellular transplantation conditions (n = 5
animals, 3 and 7 weeks post surgery). Regenerated peripheral nerve tissue
samples were stained for myelin, epon embedded and
semi-thin (1 µm) and ultra-thin (50 nm) cross sections morph metrically
analyzed. Transplantation of ahSC significantly
increased peripheral nerve gap repair in comparison to acellular
transplantation conditions. Morphometrical
analysis revealed: (1) higher cross sectional area of regenerated nerve
tissue, (2) higher numbers of regenerated myelinated
axons, (3) higher nerve densities and (4) higher grade of vascularization
at the mid point of gap-bridging nerve tissue regenerated after ahSC transplantation. Analysis of the ultrastructure
of regenerated axons displayed regular as well as irregular myelin profiles,
along with the presence of some invading macrophages which were not detected
by immunohistochemical analysis of frozen sections
as described above. In an initial attempt to transplant ahSC over-expressing FGF-2, cells were nucleofected and over-expression of FLAG-tagged FGF-218kD
was induced prior to transplantation into 10 mm nerve gaps reconstructed by
silicone tubes.Three and seven weeks after surgery
all animals (n=3 each) demonstrated regenerated nerve tissue which has to be
evaluated for the presence of FGF-218kD-3XFLAG over-expressing ahSC in the future. However, successful tissue regeneration
indicates that the transfected ahSC
survived transplantation and supported the regeneration process.
The current study contributes to a better understanding of cellular events
occurring after transplantation of ahSC into
peripheral nerve gaps, which is of clinical interest. Furthermore, for the
first time a nucleofection protocol was established
allowing non-viral transfection of ahSC paving the way for ex vivo gene therapy approaches
in peripheral nerve reconstruction in human
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Keywords
(3 dt. + 3
engl.)
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Schwann-Zellen, periphere
Nervenregeneration, FGF-2; Schwann cells, peripheral nerve regeneration, FGF-2
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