Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Sukhada Chaturvedi

 

Transplantation of physiological and genetically modified adult Schwann cells

to promote regeneration of peripheral nerves across long nerve gaps

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-97273

title (ger.)

Transplantation physiologisch normaler, genetisch veränderter adulter Schwann-Zellen zur Förderung der Regeneration peripher Nerven über große Distanzen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2009

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/chaturvedis_ss09.pdf

abstract (deutsch)

Im Rahmen der vorliegenden PhD-These wurde das Potential transplantierter adulter humaner Schwann-Zellen (ahSZ) und adulter Ratten-Schwann-Zellen (arSZ) zur Verbesserung der peripheren Nervenregeneration über große Nervenlücken untersucht. Dabei wurde das Schwann-Zell-Schicksal und die Funktion der Schwann-Zellen in einem Rattenmodel mit Rekonstruktion des Nervus ischiadicus untersucht. Primäre ahSZ und arSZ wurden isoliert, in vitro angereichert und vermehrt. Die nicht-virale Transfektion adulter Schwann-Zellen mittels der “Nucleofection” Technik (Amaxa) wurde mit dem Endziel der Induktion der Überexpression von Fibroblasten-Wachstums-Faktor-2 (FGF-2) etabliert. Die Nutzung des “primary endothelial cell nucleofection kit” in Kombination mit dem Nuclefection-Programm T-30 (Amaxa-Gerät II) bewies sich als am besten geeignet um optimale Überlebens- und Transfektionraten in sowohl ahSZ als auch arSZ zu erzielen. Adulte Schwann-Zellen sollten nach ihrer Transplantation in periphere Nervenlücken (10 mm), die mit Silikonröhrchen überbrückt wurden, identifiziert und lokalisiert werden. Deshalb wurden diese Zellen vor der Transplantation mit einem fluoreszierenden Zelllinker (PKH26-GL) an ihrer Oberfläche markiert. Schicksal und Überleben naiver ahSZ und arSZ wurden 2, 4 und 6 Wochen nach ihrer Transplantation in Nervus ischiadicus-Lücken adulter Ratten evaluiert. Nach Ende der Beobachtungsräume wurden an Längs-Gefrierschnitten durch das regenerierte Nervengewebe immunhistologische Techniken angewandt um regenerierende Nervenfasern (Growth associated protein-43, GAP-43), Myelin (Protein Zero) und Myelin menschlichen Ursprungs (Peripheral Myelin Protein-22, PMP-22) sowie eingewanderte Makrophagen (ED-1 Oberflächen-Molekül) detektieren zu können. Die Ergebnisse zeigten, dass ahSZ und arSZ nach PKH-26GL-Markierung eine Transplantation überlebten und bis zu 6 Wochen später lokalisiert werden können. Außerdem zeigten die zuvor markierten ahSZ 6 Wochen nach Transplantation (1) eine heterogene Verteilung und eine enge Assoziation mit regenerierenden Axonen (anti-GAP-43-Markierung) und (2) eine bevorzugte periphere Lokalisation in der regenerierten Gewebebrücke. Eine Beteiligung transplantierter ahSZ an der Myelinisierung regenerierter Axone konnte aber nicht nachgewiesen werden (anti-PMP-22-Markierung. Zur Evaluation der Effekte der Transplantation von ahSZ auf die Regeneration peripherer Nervenlücken, wurde dies Maßnahme mit der zellfreien Rekonstruktion der Nervenlücken verglichen (n = 5 Tiere, 3 und 7 Wochen nach Transplantation). Das regenerierte periphere Nervengewebe wurde nach einer Myelinfärbung in Epon eingebettet und semidünne (1 µm) und ultradünne (50 nm) Querschnitte morphometrisch analysiert. Die Transplantation von ahSZ erhöhte gegenüber der zellfreien Nervenrekonstruktion signifikant die Wiederherstellung der Gewebekontinuität. Die morphometrische Analyse zeigte: (1) Größere Querschnittsflächen des regenerierten Gewebes, (2) eine größere Anzahl regenerierter myelinisierter Axone, (3) höhere Nervendichten und (4) einen höhere Vaskularisierungsgrad in der Mitte der regenerierten Gewebebrücken nach Transplantation von ahSZ. Die ultrastrukturelle Analyse zeigte sowohl reguläre als irreguläre Myelinformierung und die Anwesenheit weniger eingewanderter Makrophagen, welche mit den oben erwähnten immunhistologischen Methoden nicht detektiert wurden. In einem ersten Versuch ahSZ zu transplantieren, die FGF-2 überexprimieren, wurde in diesen Zellen mittels Nucleofection die Überexpression von mit Flag-verknüpften FGF-218kD induziert. Die Zellen wurden dann in mit Silikonröhrchen rekonstruierte 10 mm große Nervenlücken der Ratte transplantiert. Drei und 7 Wochen später war in allen Tieren (n = 3 pro Zeitpunkt) die Kontinuität der Nerven wiederhergestellt. Das Gewebe muss zukünftig auf die Anwesenheit von FGF-218kD-flag exprimierenden ahSZ untersucht werden. Dennoch weist die erfolgreiche Gewebewiederherstellung darauf hin, dass die transfizierten ahSC die Transplantation überlebten und den Regenerationsprozess unterstützt haben. Die vorliegende Studie trägt zu einem besseren Verständnis zellulärer Prozesse nach Transplantation on ahSZ in periphere Nervenlücken bei, was von klinischem Interesse ist. Darüber hinaus wurde zum ersten Mal ein Protokoll zur Anwendung der Nucelofection zur nicht-viralen Transfektion von ahSZ etabliert. Dieses eröffnet  den Weg für die ex vivo-Gentherapie als Maßnahme in der Rekonstruktion menschlicher peripherer Nerven.

 

abstract (englisch)

Within the current PhD-Thesis, the potential of transplanted adult human Schwann cells (ahSC) and adult rat Schwann cells (arSC) to improve peripheral nerve regeneration across long gaps was investigated and analyzed regarding cell fate and function in an adult rat model of sciatic nerve repair. Primary ahSC and arSC were isolated, enriched and proliferated in vitro. Non-viral transfection of adult Schwann cells by the nucleofection technique (Amaxa) was established to finally induce over-expression of fibroblast growth factor-2 (FGF-2). The use of primary endothelial cell nucleofection kit in combination with the T-30 nucleofection program (Amaxa device II) proved to result in optimal survival and transfection rates, both for ahSC and arSC. To identify and localize adult Schwann cells after transplantation into peripheral nerve gaps (10 mm) bridged by silicone tubes, the cells were prior to transplantation labeled using a fluorescent linker (PKH26-GL). Fate and survival of naïve ahSC and arSC were analyzed 2, 4, and 6 weeks after transplantation into adult rat sciatic nerve gaps. After the end of the observation periods, longitudinal frozen sections of the regenerated nerve tissue were analyzed using immunohistological techniques to detect regenerating nerve fibers (Growth Associated Protein-43, GAP-43), myelin (Protein Zero), human-specific myelin (Peripheral Myelin Protein-22, PMP-22) and macrophages (surface protein, ED-1). The results demonstrate that ahSC and arSC survive and can be localized by their PKH26-GL pre-labeling up to 6 weeks after transplantation. Additionally, pre-labeled ahSC displayed: (1) heterogeneous distribution and close association with regenerating axons (anti-GAP-43 staining), 6 weeks post surgery, (2) a preferential peripheral localization in the longitudinal section of regenerated tissue cable. However, a contribution of transplanted ahSC to the myelination of regenerated axons could not be demonstrated (anti-PMP-22 staining). To detect effects of ahSC transplantation on peripheral nerve regeneration across nerve gaps, this attempt was compared to acellular transplantation conditions (n = 5 animals, 3 and 7 weeks post surgery). Regenerated peripheral nerve tissue samples were stained for myelin, epon embedded and semi-thin (1 µm) and ultra-thin (50 nm) cross sections morph metrically analyzed. Transplantation of ahSC significantly increased peripheral nerve gap repair in comparison to acellular transplantation conditions. Morphometrical analysis revealed: (1) higher cross sectional area of regenerated nerve tissue, (2) higher numbers of regenerated myelinated axons, (3) higher nerve densities and (4) higher grade of vascularization at the mid point of gap-bridging nerve tissue regenerated after ahSC transplantation. Analysis of the ultrastructure of regenerated axons displayed regular as well as irregular myelin profiles, along with the presence of some invading macrophages which were not detected by immunohistochemical analysis of frozen sections as described above. In an initial attempt to transplant ahSC over-expressing FGF-2, cells were nucleofected and over-expression of FLAG-tagged FGF-218kD was induced prior to transplantation into 10 mm nerve gaps reconstructed by silicone tubes.Three and seven weeks after surgery all animals (n=3 each) demonstrated regenerated nerve tissue which has to be evaluated for the presence of FGF-218kD-3XFLAG over-expressing ahSC in the future. However, successful tissue regeneration indicates that the transfected ahSC survived transplantation and supported the regeneration process. The current study contributes to a better understanding of cellular events occurring after transplantation of ahSC into peripheral nerve gaps, which is of clinical interest. Furthermore, for the first time a nucleofection protocol was established allowing non-viral transfection of ahSC paving the way for ex vivo gene therapy approaches in peripheral nerve reconstruction in human

 

Keywords

(3 dt. + 3 engl.)

Schwann-Zellen, periphere Nervenregeneration, FGF-2; Schwann cells, peripheral nerve regeneration, FGF-2

kb

11.361