Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Anja Cehak

 

Investigation regarding the epithelial electrolyte and nutrient transport across the intestinal mucosa in the horse

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-102823

title (ger.)

Untersuchungen zum epithelialen Elektrolyt- und Nährstofftransport der intestinalen Mukosa des Pferdes

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/cehaka_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Transepitheliale Transportmechanismen des Gastrointestinaltraktes sind wesentlich an der Regulation des Elektrolythaushaltes und der Absorption von Nährstoffen beteiligt. Beim Pferd haben Erkrankungen des Intestinaltraktes eine hohe Inzidenz, und sie sind häufig mit Störungen des Elektrolythaushaltes assoziiert. Bisher sind nur wenige Studien zu transportphysiologischen Messungen an intestinalen Epithelien des Pferdes publiziert, und über die Existenz und die Bedeutung der meisten Transportmechanismen beim Pferd liegen zum jetzigen Zeitpunkt keine Informationen vor.

Ziel der Studie war es, die epithelialen Transportmechanismen von Elektrolyten und Nährstoffen an der intestinalen Mukosa des Pferdes mit Hilfe der Ussingkammer-Technik, der Radioisotopen-Tracer-Technik sowie mit Aufnahmestudien in Bürstensaummembranvesikel (BSMV) funktionell zu charakterisieren. Die Untersuchung des Transports von Glukose, L-Alanin und Glycyl-L-Glutamin erfolgte durch Bestimmung elektrophysiologischer Parameter in Ussingkammern. Der Effekt verschiedener luminaler pH-Werte auf den Nährstofftransport wurde bestimmt. Die Cl--Sekretion wurde mittels Stimulanzien und Hemmstoffen der verschiedenen  Cl--Sekretionswege untersucht. Die Untersuchungen des transepithelialen Ca2+- und Pi-Transports entlang der Darmachse erfolgten durch Kalkulation der unidirektionalen Fluxraten von Ca2+ und Pi an den verschiedenen Darmsegmenten. Desweiteren wurden der Effekt von Verapamil auf den Ca2+-Transport sowie der Effekt von Ouabain auf den Pi-Transport bestimmt. Die Existenz und die funktionellen Eigenschaften des jejunalen Peptidtransportes wurden durch Bestimmung der unidirektionalen Fluxraten von Glycyl-L-Glutamin und durch Aufnahmestudien in Bürstensaummembranvesikel (BSMV) untersucht.

Im Rahmen der Ussingkammerversuche erfolgte eine kontinuierliche Messung von Kurzschlussstrom und Gewebleitfähigkeit. Die Zugabe von Glukose, L-Alanin und Glycyl-L-Glutamin führten zu einem Anstieg des Kurzschlussstroms, der bei einem luminalen pH-Wert von 7.4 signifikant höher war als bei einem pH-Wert von 5.4.

Um die apikalen Na+- und K+-Kanäle zu blockieren, erfolgte eine Präinkubation mit Amilorid, TEA und Barium. Letzteres verursachte einen signifikanten Anstieg des Kurzschlussstroms, was darauf hinweist, das eine apikale K+-Sekretion wesentlich zum basalen Kurzschlussstrom beiträgt. Die anschließenden Zugaben von Carbachol und Forskolin führten zu einem Anstieg des Kurzschlussstroms, der eine stimulierte Cl--Sekretion repräsentierte. Zur Differenzierung verschiedener Cl--Kanäle wurde der Effekt von DIDS, NPPB, Glibenclamid, CFTRinh-172, und GlyH-101 auf die stimulierte Cl--Sekretion gemessen, und die Dosis-Wirkungskurven der Cl--Inhibitoren bestimmt. Keiner der verwendeten Hemmstoffe führte zu einer signifikanten Veränderung des Kurzschlussstroms.

Positive Ca2+-Nettofluxraten wurden in allen untersuchten Segmenten des Intestinaltraktes bestimmt, ein Hinweis auf die Ca2+-Absorptionsfähigkeit des Darmes entlang der gesamten Darmachse. Die Ca2+-Transportraten zwischen den unterschiedlichen Segmenten waren signifikant verschieden, wobei die höchsten Ca2+-Nettofluxraten im Duodenum festgestellt wurden. Sie waren 10-fach höher als die jejunalen Ca2+-Nettofluxraten. Die niedrigsten Ca2+-Nettofluxraten wurden im dorsalen Kolon bestimmt. Der jejunale Ca2+-Transport wurde durch Verapamil signifikant gehemmt.

Die jejunalen Pi-Fluxraten von serosal nach mukosal waren signifikant höher als die Pi-Fluxraten von mukosal nach serosal, ein Hinweis darauf, dass Pi im Jejunum des Pferdes sezerniert wird. Entlang der Darmachse waren die Pi-Nettofluxraten in Folge der nur geringfügig unterschiedlichen unidirektionalen Pi-Fluxraten sehr niedrig, so dass keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden konnten. Durch Zugabe von Ouabain wurde der Pi-Transport im Jejunum signifikant gehemmt.

Bei den Ussingkammerversuchen zum Peptidtransport ergab die Zugabe von Glycyl-L-Glutamin einen signifikant höheren Anstieg des Kurzschlussstroms als die Zugabe von Glycyl-Sarkosin. Es wurden positive Nettofluxraten von Glycyl-L-Glutamin im Jejunum bestimmt, was darauf hindeutet, dass das Dipeptid im Jejunum absorbiert wird. Durch Zugabe von Glycyl-Sarkosin wurden die Nettofluxraten von Glycyl-L-Glutamin signifikant gehemmt, ein Hinweis, dass beide Dipeptide um denselben Transportmechanismus konkurrieren. Ein saurer luminaler pH-Wert beeinflusste die Fluxraten nicht.

Um die funktionellen Eigenschaften des Peptidtransportes besser zu evaluieren, wurden mittels modifizierter Mg2+-EGTA-Präzipitationsmethode jejunale BSMV präpariert, und Aufnahmestudien zum Glukose- und Peptidtransport mit Hilfe der Schnellfiltrationstechnik durchgeführt. Die funktionelle Integrität der Vesikel wurde durch die Na+-abhängige Glukoseaufnahme bestätigt. Die Aufnahme von Glycyl-L-Glutamin in die Vesikel wurde in An- und Abwesenheit eines einwärts gerichteten H+- oder Na+-Gradienten durchgeführt. Ein Overshoot-Phänomen (schnelle initiale Aufnahme von Glycyl-L-Glutamin in die Vesikel über den eigentlichen Konzentrationsausgleich zwischen extra- und intravesikulärem Raum hinaus) wurde sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit eines H+-Gradienten beobachtet, wobei die H+-abhängige Aufnahme signifikant höher war als die Aufnahme ohne Anwesenheit des H+-Gradienten. Ein Na+-Gradient induzierte kein Overshoot-Phänomen. Konzentrationsabhängige Aufnahmen von Glycyl-L-Glutamin in die Vesikel wiesen hyperbolische Verläufe auf, die der Michaelis-Menten-Kinetik entsprechen. Der Km-Wert der H+-abhängigen Glycyl-L-Glutamin Aufnahme weist auf die Existenz eines PepT1 beim Pferd hin. Der Km-Wert für die Glycyl-L-Glutamin Aufnahme in Abwesenheit eines Gradienten unterschied sich signifikant von dem Km-Wert der H+-abhängigen Aufnahme, ein Hinweis für die Existenz zweier verschiedener Transportsysteme für die Peptidaufnahme beim Pferd.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen erstmalig, dass Peptide über die Darmwand des Pferdes transportiert werden. Das Duodenum erwies sich als wichtigster Darmabschnitt für die Ca2+-Absorption, und eine für das Pferd spezifische transportphysiologische Eigenschaft des Intestinaltraktes, die Pi-Sekretionsfähigkeit, wurde im Jejunum nachgewiesen. In Anbetracht fehlender Effekte der Cl--Kanal-Inhibitoren auf den Cl--Transport, bleibt die in vitro Untersuchung der intestinalen Cl--Sekretion des Pferdes eine Herausforderung.

 

abstract (englisch)

Transepithelial transport mechanisms play a key role in regulating the absorption and secretion of electrolytes and nutrients in the gastrointestinal tract. In the horse, intestinal disorders are the most common pathologic conditions, often associated with imbalances in macromineral homeostasis. Published data on equine intestinal transport are limited, and the existence and the relevance of most underlying transport mechanisms are still unknown.

The aim of the present study was to characterize the transport mechanisms of electrolytes and nutrients across the intestine in healthy horses using the Ussing chamber technique, the radioisotopes tracer technique, and uptake studies into BBMV. Transport of glucose, alanine and glycyl-L-glutamine across the jejunum was analysed by determining electrophysiological parameters in response to nutrient addition in Ussing chambers. The effect of different luminal pH values (7.4 and 5.4) on nutrient transport was determined. Cl- secretion was analysed by determining the effect of different stimulants and inhibitors on electrogenic Cl- secretion. Transepithelial transport of Ca2+ and Pi transport along the intestinal axis was investigated by calculating unidirectional flux rates of Ca2+ and Pi at different intestinal segments. The effect of verapamil on jejunal Ca2+ transport and the influence of ouabain on jejunal Pi transport were documented. The existence and characteristics of jejunal dipeptide transport were investigated by determining unidirectional flux rates of glycyl-L-glutamine in Ussing chambers and by uptake studies into BBMV.

For Ussing chamber experiments the stripped mucosa was mounted in Ussing chambers and Isc and Gt were continuously monitored. The addition of glucose, L-alanine and glycyl-L-glutamine induced an increase in Isc that was significantly greater at pH 7.4 than at pH 5.4.

For blocking apical Na+ and K+ channels, tissues were preincubated with amiloride, TEA and barium. The latter induced a significant increase in Isc indicating that K+ currents contribute to basal Isc in equine small intestine. The subsequent addition of carbachol and forskolin induced an Isc increase representing stimulated Cl- secretion. For differentiation of different Cl- channels, the effect of DIDS, NPPB, glibenclamide, CFTRinh-172, and GlyH-101 on stimulated Cl- secretion was analysed, and their dose-response effect was investigated. None of the Cl- channel inhibitors changed Isc significantly, irrespective of the dose applied.

Positive net flux rates of Ca2+ were determined in all intestinal segments indicating absorptive capacity for Ca2+ along the entire intestinal axis. Ca2+ transport was significantly different between intestinal segments with the duodenum showing the highest Ca2+ net flux rates. Duodenal Ca2+ net flux rates were 10-fold higher than jejunal Ca2+ net flux rates, and flux rates were lowest in the dorsal colon. Jejunal Ca2+ transport was significantly inhibited by verapamil.

Regarding the Pi transport, serosal-to-mucosal flux rates of Pi across the jejunum were significantly higher than the mucosal-serosal flux rates indicating that the equine jejunum is capable of Pi secretion. Along the intestinal axis, net flux rates of Pi were low as a result of relatively small differences in unidirectional flux rates, and thus, no significant differences between intestinal segments were detected. Ouabain significantly inhibited jejunal Pi transport.

Regarding the peptide transport, the Isc response to luminal addition of glycyl-L-glutamine was significantly greater compared to the Isc response to glycyl-sarcosine addition. Positive net flux rates of glycyl-L-glutamine were determined across the jejunum indicating absorption of the dipeptide. The addition of glycyl-sarcosine reduced the flux rates significantly suggesting that both dipeptides compete for the same transport system. The flux rates were not affected by changes in luminal pH.

For analysing dipeptide transport in more detail, BBMV were prepared from jejunal samples using a modified Mg2+-EGTA-precipitation-method, and uptakes of glucose and glycyl-L-glutamine into BBMV were determined by rapid filtration technique. Functional integrity of the vesicles was confirmed by a Na+-dependent glucose uptake into the vesicles. Uptakes of glycyl-L-glutamine into BBMV were performed in the presence and absence of an inwardly directed H+ or Na+ gradient. An overshoot phenomenon was demonstrated in both the absence and the presence of an inwardly directed H+-gradient, with the H+-mediated transport being significantly greater than the transport under equilibrium conditions. A Na+-gradient did not cause an overshoot phenomenon. Glycyl-L-glutamine uptakes displayed Michaelis-Menten type saturation kinetic with a Km value for the H+-dependent glycyl-L-glutamine uptake being suggestive of a PepT1. The Km value for the glycyl-L-glutamine uptake under equilibrium conditions was significantly different from the Km obtained for the H+-dependent uptake indicating the existence of two different peptide transport mechanisms in the horse: one active H+-dependent cotransport and one driven by a mechanism other than a H+- or a Na+-gradient.

In conclusion, the thesis demonstrates for the first time that peptides are transported across the equine small intestine. The duodenum was found to be most important for Ca2+ absorption, and a distinct feature of equine intestinal physiology, the capability of Pi secretion in the jejunum was documented. In respect to the absent effects of Cl- channel inhibitors on Cl- transport, in vitro investigations on intestinal Cl- secretion remain a challenge in horses.

 

keywords

Transportmechanismen, Intestinaltrakt, Pferd, transport mechanisms, intestine, horse

kb

302