Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Nina Burmester-Kintrup

Einfluss der In-vitro-Maturationsbedingungen boviner Oozyten auf die Proteinexpression des Progesteronrezeptors

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104591

title (engl.)

Influence of in vitro maturation conditions bovine oocytes on protein expression of the progesterone receptor

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/burmester-kintrupn_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss unterschiedlicher In-vitro-Reifungsbedingungen auf die molekulare Qualität boviner Kumuluszellen und Oozyten zu untersuchen. Von November 2010 bis Februar 2011 wurden insgesamt (n=962) Kumulus-Oozyten-Komplexe aus Schlachthofovarien gewonnen und entweder bei 5% O2 oder bei 20% O2 gereift. Das Steroidhormon Progesteron ist lipophil und aufgrund dieser Eigenschaft wurde zusätzlich der Einfluss einer Ölüberschichtung des Mediums (TCM 199) bei den respektiven Sauerstoffkonzentrationen untersucht. Insgesamt gab es fünf Versuchsgruppen: unreif, 5% Öl; 5% ölfrei, 20% Öl und 20% ölfrei. Im Anschluss an die Maturationsphase wurden die Kumuluszellen manuell entfernt. Um die Kernreifungsrate zu ermitteln, erfolgte die Fixierung und anschließende Färbung von 279 Oozyten aus allen Gruppen. Im Weiteren wurde die mRNA-Expression entwicklungsrelevanter Gene sowohl in Oozyten (SLC2A1, GDF9, BMP15, EPAS1, PGR, PAQR5, PGRMC1, PGRMC2) als auch in Kumuluszellen (STAR, HSD3B1, CYP19A1, PTGS2, cPLA2, PPARγ, PTGFR, PGR, LHCGR, FSHR) mittels RT-qPCR untersucht. Die Ermittlung der relativen Proteinmenge des nuklearen Progesteronrezeptors (nPR) erfolgte mit der Western Blot-Analyse und einem nachfolgenden Chemilumineszenzverfahren. Es konnten folgende Ergebnisse erzielt werden:

 

1. Die durchschnittliche Kernreifungsrate wies keinen signifikanten Unterschied innerhalb der verschiedenen Gruppen auf und lag zwischen 83 und 88 %.

 

2. Der relative mRNA-Gehalt des PGR war in Oozyten, die bei einer O2-Konzentration von 20% reiften, signifikant höher als in Eizellen, die unter einer geringeren O2-Konzentration (5%) reiften.

 

3. Wenn die IVM unter einer O2-Konzentration von 5% durchgeführt wurde, war in Kumuluszellen der relative Gehalt von STAR-, CYP19A1-, PTGFR-, LHCGR-, FSHR-mRNA und in Oozyten die relative Menge von GDF9-mRNA signifikant höher als bei einer IVM unter einer hohen (20%) O2-Konzentration.

 

4. In den Gruppen mit einer Silikonölüberschichtung des Reifungsmediums waren die relativen Transkriptmengen von STAR, CYP19A1 und PTGFR in reifen Kumuluszellen im Gegensatz zu den Gruppen ohne Ölüberschichtung des Maturationsmediums signifikant erhöht. In Oozyten, die in Medium gereift wurden, welches nicht mit Öl überschichtet wurde, war die relative Transkriptmenge von GDF9 und BMP15 signifikant höher als in solchen, bei denen das Maturationsmedium mit Öl überschichtet war.

 

5. Auf Proteinebene konnte in unreifen und reifen Oozyten sowie in reifen Kumuluszellen die Isoform B des nPRs und in unreifen und reifen Kumuluszellen die Isoformen A und C des nPRs identifiziert werden.

 

6. In reifen Kumuluszellen war die relative Proteinmenge der Isoformen B und C des nPRs sowie in reifen Oozyten die der Isoform B signifikant erhöht, wenn die IVM unabhängig von der Ölüberschichtung bei einer O2-Konzentration von 20% erfolgte. 

 

7. In reifen Kumuluszellen war beim Einsatz eines ölüberschichteten Reifungsmediums die Proteinexpression der Isoform B des nPRs im Gegensatz zu der Reifung in Maturationsmediums ohne Silikonölüberschichtung signifikant erhöht.

 

8. Bei der Analyse des Progesterongehaltes im Reifungsmedium zeigte sich eine Interaktion zwischen der Ölüberschichtung und der O2-Konzentration. Je höher die O2-Konzentration während der IVM, desto höher die Progesteronmenge im Reifungsmedium. Die höchste Progesteronmenge je KOK konnte in der Gruppe 20% ölfrei (303,5 ±18,5 ng/KOK) gemessen werden.

 

In dieser Studie wurde erstmals der Einfluss der Sauerstoff- und der Progesteronkonzentration im Reifungsmedium auf die Ausbildung der nPR-Isoformen A, B und C in reifen bovinen Kumuluszellen und Oozyten dargestellt. Der relative mRNA-Gehalt des PGR und die relative Proteinmenge der nPR-Isoformen B und C war abhängig von der O2-Konzentration während der IVM. Wurde die Reifung der KOK unter einer atmosphärischen O2-Konzentration (20%) durchgeführt, war der relative mRNA-Gehalt des PGR in reifen Oozyten und die relative Proteinmenge der nPR-Isoformen B und C in reifen Kumuluszellen signifikant höher als in den Vergleichsgruppen. Die Proteinexpression der Isoform B wurde ebenfalls durch die Progesteronkonzentration im Medium beeinflusst. In Kumuluszellen, die im ölüberschichteten Maturationsmedium reiften, war die relative Proteinmenge der Isoform B signifikant höher als in denen aller anderen Versuchsgruppen. Auch die relativen mRNA-Gehalte für Gene, die an der Steroidsynthese beteiligt (STAR, HSD3B1, CYP19A1 und LHCGR) sind, wiesen eine Abhängigkeit von der Ölüberschichtung des Reifungsmediums auf. So waren diese bei einer niedrigeren Progesteronkonzentration im Medium erhöht.

Ob sich die Auswirkungen der verschiedenen IVM-Bedingungen (O2- und Progesteronkonzentration) auf die Proteinexpression des nPR auch im Weiteren die Entwicklungskompetenz der Oozyte beeinflusst, könnte durch weitere Untersuchungen, in denen morphologische Kriterien, wie z.B. die Blastozystenrate, und/oder in denen entwicklungsrelevante Gene auf mRNA- und Proteinebene  analysiert werden, erfolgen. Die Analyse von speziellen Transkripten (z.B. Thioredoxin interacting protein) stellt eine Möglichkeit dar, festzustellen, ob unter einer geringen O2-Konzentration während der IVM oxidativer Stress in der Oozyte überhaupt vorliegt.

 

abstract (englisch)

The aim of the present study was to investigate the influence of different in vitro maturation conditions on the molecular quality of bovine oocytes and cumulus cells . From November 2010 to February 2011, in total (n = 962) cumulus-oocyte complexes were obtained from ovaries of cattle slaughtered at a local abattoir and matured either at 5% O2 or 20% O2. The steroid hormone progesterone is lipophilic and due to this property it will diffuse into the oil with which IVM media are traditionally overlaid. The influence of an oil overlay of the medium (TCM 199) with the respective oxygen concentrations was also investigated. Overall, there were five experimental groups: immature, 5% oil, 5% oil-free, 20% oil and 20% oil-free. After IVM the cumulus cells were mechanically removed. To determine the nuclear maturation rate 279 oocysts from all groups were fixed and subsequently stained. Furthermore, the mRNA expression of development-related genes in both oocytes (SLC2A1, GDF9, BMP15, EPAS1, PGR, PAQR5, PGRMC1, PGRMC2) and cumulus cells (STAR, HSD3B1, CYP19A1, PTGS2, cPLA2, PPARγ, PTGFR, PGR, LHCGR, FSHR) were examined by RT-qPCR. The relative amount of protein of the nuclear progesterone receptor (nPR) was determined using the western blot analysis with subsequent chemiluminescence. The following results were obtained:

 

1. The average nuclear maturation rates (83-88%) did not differ among groups.

 

2. The relative mRNA content of PGR in oocytes matured under an O2-concentration of 20%, was significantly higher than in oocytes that were matured under a lower O2-concentration (5%).

 

3. When IVM was performed under an O2-concentration of 5% the relative amount of STAR, CYP19A1, PTGFR, LHCGR, FSHR-mRNA in cumulus cells and the relative amount of GDF9-mRNA in oocytes was significantly higher than in those after IVM under a high (20%) O2-concentration.

 

4. In the groups with an oil overlay of the maturation medium the relative transcript levels of STAR, CYP19A1 and PTGFR were significantly increased in matured cumulus cells in contrast to the groups without an oil overlay. In oocytes matured in medium that was not coated with oil, the relative amount of GDF9 and BMP15 transcripts was significantly higher than in those matured in maturation medium which was overlayed with oil.

 

5. At the protein level, the isoform B of the nPR was identified in immature and matured oocytes as well as in matured cumulus cells and the isoforms A and C in immature and matured cumulus cells.

 

6. The relative amount of nPR isoforms B and C in matured cumulus cells as well as the isoform B in matured oocytes were significantly increased independent of the oil overlay when IVM was carried out at an O2-concentration of 20%.

 

7. In matured cumulus cells the protein expression of the nPR isoform B was significantly increased if the an oil overlay of the medium was employed

 

8. The analysis of the progesterone concentration in the maturation medium showed an interaction between the oil overlay and the O2-concentration. The higher the O2-concentration was during IVM, the higher was the amount of progesterone in the maturation medium. The highest amount of progesterone per COC was measured in the 20% oil-free group (303.5 ± 18.5 ng/COCs).

 

In this study for the first time, the influence of oxygen and progesterone on the formation of nPR isoforms A, B and C in mature bovine cumulus cells and oocytes was shown. The relative mRNA content of the PGR and the relative amount of protein of nPR isoforms B and C is dependant on the O2-concentration during IVM. When maturation is performed under an atmospheric O2-concentration (20%), the relative mRNA content of the PGR in mature oocytes and the relative amount of protein of the nPR isoform B and C in mature cumulus cells was significantly higher than in those of all other groups. The protein expression of the B isoform was also influenced by the progesterone concentration in the medium. In cumulus cells, matured with a siliconoil overlay, the relative amount of protein isoform B was significantly higher than those of all other experimental groups. Inaddition, the relative mRNA levels for genes involved in steroid synthesis (STAR, HSD3B1, CYP19A1 and LHCGR) were dependant on the oil overlay of the maturation medium. Whether the differential expression of the nPR influences the developmental competence of the oocyte has to be assessed in further studies. Here morphological criteria such as blastocyst rates, mRNA and/or protein expression of developmental-related genes should be analysed. The analysis of specific transcripts (eg. thioredoxin interacting protein) may clarify whether oxidative stress is present in the oocyte under a low O2-concentration during IVM.

 

keywords

IVM, Progesteronrezeptor, Protein, progesterone receptor 

kb

11.200