Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Birgit Burchardt

Erstellung von Interspezieschimären mit

induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs)

von Maus, Schwein und Affe

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109693

title (eng.)

Generation of interspecies chimeras with induced pluripotent stem cells (iPSC's) of mouse, pig and non-human monkey

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/burchardtb_ss17.pdf

abstract (deutsch)

Die Organtransplantation ist eine etablierte Therapie für Patienten mit terminalem Organversagen. Der Bedarf liegt dabei deutlich über der Anzahl der für die Transplantation vorhandenen Organe. Um der großen Diskrepanz zwischen benötigten und verfügbaren Organen für die Organtransplantation in den Menschen entgegenzuwirken, ist es erforderlich, nach Alternativen zu der Allotransplantation (Übertragung von Gewebe oder Organen zwischen zwei Lebewesen der gleichen Spezies) zu suchen. Eine Möglichkeit ist die Erstellung von humanen Organen in einem porzinen Organismus. Der Einsatz von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) könnte die Generierung individualisierter Spenderorgane ermöglichen und die Gefahr einer Abstoßung des Organs minimieren. Hauptzielsetzung dieser Arbeit war die Ermittlung des besten Zeitpunktes für die Chimärenbildung in der frühen Embryonalentwicklung von parthenogenetischen Schweineembryonen mit iPSCs von Javaneraffen. Zunächst wurde die Aggregation in unserem Labor an murinen Embryonen und iPSCs mit erfolgreicher Produktion von lebenden Chimären etabliert. Bei der Übertragung der Versuche auf parthenogenetischen Schweineembryonen zeigte sich, dass das standardmäßig für die Kultivierung der Embryonen genutzte Medium (Porzines Zygoten Medium 3, PZM-3) keine Proliferation der Javaneraffen-iPSCs ermöglichte. Daher wurde die Zugabe von 10 % bis 50 % Stammzellmedium in PZM-3 getestet. Abhängig vom genutzten Medium konnte eine Konzentration von bis zu 25 % Stammzellmedium von 3 Tage alten Embryonen (8-Zell Stadium) toleriert werden. Die Entwicklung zu Blastozysten wurde von Embryonen ab dem Morulastadium (Tag 4) durch die Zugabe von Stammzellmedium nicht mehr negativ beeinflusst. Die Aggregationsrate zwischen parthenogenetischen porzinen Embryonen war dagegen bei 3 Tage alten Embryonen deutlich höher als bei 4 Tage alten Embryonen. Daher wurde die Chimärenbildung von Embryonen und iPS-Zellen mit parthenogenetischen porzinen Embryonen im 8-Zell Stadium (Tag 3) durchgeführt. Bei Aggregaten der Embryonen mit porzinen iPSCs konnte ein deutlich höherer Anteil an iPSC-positiven Blastozysten nachgewiesen werden als bei der Aggregation mit iPSCs von Javaneraffen. Auch eine Proliferation konnte nur bei porzinen iPSCs gezeigt werden. Zusammenfassend konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche gezeigt werden, dass die Bildung von Interspezieschimären durch Aggregation von porzinen parthenogenetischen Embryonen mit Javaneraffen-iPSCs möglich ist. Es war jedoch notwendig, das verwendete Kulturmedium auf Embryonen und iPS-Zellen abzustimmen, um eine erfolgreiche Chimärenerstellung zu ermöglichen. Die Integration der iPS-Zellen wurde durch die Aggregation mit Tag 3 Präimplantationsembryonen jedoch nicht verbessert. Die Überlebensrate der Javaneraffen-iPSCs nach der Aggregationsmethode war geringer als in vergleichbaren Injektionsversuchen mit Tag 4 porzinen parthenogenetischen Embryonen.

abstract (englisch)

Organ transplantation is an established therapy for patients with end-stage organ failure. The demand for human organs is much higher than the number of donors. To close the gap between the organs available and those needed for transplantation into humans, it is necessary to look into other sources than allotransplantation (transplantation of tissue or organs between individuals of the same species). Generation of human organs in pigs is a reasonable alternative. The use of induced pluripotent stem cells (iPSC's) could allow the creation of recipient-specific organs, which minimizes the risk of transplant rejection. Aim of this work was the identification of the ideal timepoint for aggregation in early embryo development of parthenogenetic porcine embryos with iPSC's of cynomolgus monkey (ciPSC's). At first, embryo aggregation was established in our laboratory by use of murine embryos and iPSC's and succeeded in the production of viable chimeras. After transfer of these experiments to parthenogenetic pig embryos and ciPSC's, it became obvious, that cynomolgus iPSC's were not viable under culture conditions in porcine zygote medium (PZM-3). Because of that, addition of 10 % - 50 % stem cell medium to PZM-3 was tested. Medium tests showed a tolerance for up to 25 % stem cell medium in day 3 porcine embryos (8-cell stage). Blastocyst rates of day 4 embryos (morula stage) were not reduced by cultivation in stem cell medium. The aggregation rate between parthenogenetic porcine embryos was much higher between 8-cell embryos in comparison to morula-stage embryos. Finally, aggregation of embryo-iPSC chimeras with porcine and cynomolgus iPSC's was tested. Evaluation of blastocysts at day 6, porcine iPSC's yielded a higher rate of chimeric blastocysts than cynomolgus iPSC's. Proliferation of iPSC's could only be seen with porcine induced pluripotent stem cells. In summary, it could be shown, that generation of interspecies chimeras by aggregation of parthenogenetic porcine embryos with cynomolgus iPSC's is possible. Optimizing the culture medium for combined cultivation of embryos and iPSC's is essential for successful generation of chimeras. The aggregation method did not improve integration or survival of cynomolgus iPSC's with day 3 embryos in comparison to injection into day 4 parthenogenetic porcine embryos.

keywords

Xenotransplantation, Interspezieschimäre, induzierte pluripotente Stammzellen / xenotransplantation, interspecies chimera, induced pluripotent stem cells

kb

23.110