Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Anne Bunge

Entwicklung eines Routineverfahrens zur durchflusszytometrischen Differenzierung so-matischer Zellen in Rohmilch

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-109682

title (eng.)

Development of a routine procedure for the flow cytometric differentiation of somatic cells in raw milk

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bungea_ss17.pdf

abstract (deutsch)

Um den Antibiotikaeinsatz in der Mastitistherapie nachhaltig zu reduzieren, wird eine individuelle Bewertung der Therapiewürdigkeit jeder klinischen Mastitis empfohlen. Anhand kuh-individueller Kennzahlen aus den Daten der Milchleistungsprüfung wird derzeit eingeschätzt, ob eine antibiotische Behandlung die Heilung der Milchdrüse signifikant steigern kann oder ob eine ausschließlich antiphlogistische Therapie das Mittel der Wahl ist. Um Tiere mit einer geringen Heilungschance identifizieren zu können, soll eine Differenzierung der somatischen Zellen im Gesamtgemelk dienen. Ziel der ersten Studie war es, die Zelldifferenzierung und die Untersuchung der Zellvitalität auf Gesamtgemelksebene durchzuführen, um eine prognostische Aussage zur Heilung des Euters zu erhalten. Wenn ein Tier im Laufe der Laktation eine klinische Mastitis entwickelt, sollen jene untersuchten Zellcharakteristika aus der vorangegangenen Milchleistungsprüfung die Bewertung der Mastitisprognose unterstützen. Somit sollen therapieunwürdige Tiere bestmöglich erkannt und eine Entscheidung zur Merzung getroffen werden können.

Die Gesamtgemelke wurden zweimalig zentrifugiert, mit PBS-Puffer gewaschen, um die somatischen Zellen zu isolieren und schließlich durchflusszytometrisch analysiert, um den Anteil an großen, granulierten somatischen Zellen sowie den Anteil nicht-vitaler Zellen zu erfassen. Nachfolgend wurden die Daten des Analyseverfahrens auf Assoziationen mit der individuellen zytologischen Heilung der Kuh untersucht. Falls eine Kuh nach der Analyse eine klinische Mastitis entwickelte, wurde sie in eine zweite Teilstudie aufgenommen, um die bakteriologische Heilung zu untersuchen und diese ebenfalls mit den durchflusszytometrisch erfassten Parametern auf Beziehungen zu prüfen. Die Studie ergab, dass der gemessene Anteil an nicht-vitalen Zellen im Gesamtgemelk eine signifikante Beziehung zur zytologischen Heilung der Tiere aufwies. Ein höherer Anteil an nicht-vitalen Zellen war mit einer niedrigeren zytologischen Heilung assoziiert. Der Anteil an großen, granulierten Zellen ließ in dieser Studie auf keinen signifikanten Zusammenhang mit der Heilung schließen. Beziehungen der Zellparameter zu der bakteriologischen Heilung der Euterviertel konnten nicht festgestellt werden.

Es ergibt sich die Schlussfolgerung, dass der Anteil nicht-vitaler Zellen in Gesamtgemelksproben der Milchleistungsprüfung eine prognostische Aussagekraft zur Heilung von Mastitiden besitzt. Somit ist eine Bewertung, ob eine antibiotische Therapie die Heilung der Milchdrüse signifikant positiv beeinflusst, möglich. Es besteht folglich eine Grundlage für die Integration der Zellvitalitätsuntersuchung in die standardisierten Laboruntersuchungen der Milchleistungsprüfung. Es ist jedoch anzumerken, dass die Leukozyten in der Milchdrüse und ihre Vitalität zahlreichen umwelt-, tier- und pathogenspezifischen Einflüssen unterliegen, die eine prognostische Bewertung der kuh-individuellen Heilung erschweren können. Eine Untersuchung der bakteriologischen Heilung auf pathogenspezifischer Ebene konnte in dieser Arbeit nicht einbezogen werden, allerdings könnten zukünftig diese Untersuchungen vielversprechende Ergebnisse liefern.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine durchflusszytometrische Methode mit unzentrifugierter Milch entwickelt. Dieses Schnellverfahren wurde nachfolgend auf eine Vorhersagekraft zur Heilung mit dem Ziel geprüft, die Zelldifferenzierung in die standardisierten Laboruntersuchungen der Milchleistungsprüfung zu integrieren. Da die Laboratorien der Landeskontrollverbände mehrere Tausend Milchproben pro Tag analysieren, ist es nötig die Probenpräparation für die Differenzierung zu vereinfachen. Weil sich Milchfette und – eiweiße häufig störend auf die durchflusszytometrische Analyse auswirken, werden in den meisten Fällen, wie auch im ersten Teil dieser Arbeit, Zentrifugationsschritte angewandt. Das Ziel dieses Versuchs war folglich die Entwicklung eines Verfahrens, mit welchem mehrere Tausend Proben in einigen Stunden analysiert werden können, das einfach durchführbar ist, eine hohe Testsicherheit aufweist und dabei wenig Verbrauchsmaterialien benötigt werden.

Die Voruntersuchungen mit verschiedenen Milchverdünnungen ließen im niedrigen Fluoreszenzbereich aller Wellenlängenbereiche zahlreiche autofluoreszierende Milchbestandteile erkennen. Um diese Artefakte von somatischen Zellen trennen zu können, werden demzufolge stark fluoreszierende Farbstoffe benötigt. In dieser Studie konnte der Farbstoff Propidium Iodid im Komplex mit nicht-vitalen Zellen diesen Anforderungen gerecht werden. Allerdings emittiert dieser Farbstoff im Komplex mit vitalen somatischen Zellen nur eine schwache Fluoreszenz und wurde daher zusammen mit den autofluoreszierenden Milchbestandteilen detektiert. Da eine Quantifizierung der vitalen Zellen mit diesem Verfahren nicht möglich war, wurde im Folgenden die Zellzahl über ein fluorooptisches Zellzählsystem (SomaScope Smart) erfasst und der Anteil der nicht-vitalen Zellen an der Gesamtzellzahl auf diesem Weg ermittelt. Es konnten signifikante, aber schwache Korrelationen zwischen den Daten der Verfahren mit zentrifugierter und unzentrifugierter Milch bestätigt werden. Die Beurteilung der tierindividuellen zytologischen und bakteriologischen Heilungswahrscheinlichkeit anhand der Anteile nicht-vitaler Zellen in unzentrifugierter Rohmilch konnte in diesem Versuch jedoch nicht realisiert werden. Folglich erwies sich die in dieser Arbeit getestete durchflusszytometrische Methode mit unzentrifugierter Milch als nicht anwendbar, um eine prognostische Aussage zur Heilung einer klinischen Mastitis zu erhalten. Die Erfassung vitaler und nicht-vitaler Zellen innerhalb einer Messung und die Anwendung angepasster Fluoreszenzfarbstoffe erscheinen als maßgeblich, um eine höhere Testgenauigkeit zu erlangen.

abstract (englisch)

In order to reduce the use of antibiotics in a sustained manner it is recommended to assess the individual worthiness of therapy for every clinical mastitis case. Currently, it is estimated by the data of the Dairy Herd Improvement (DHI) test if a mammary cure would benefit from an antibiotic treatment or if the cow should only receive an antiphlogistic therapy. The differentiation of somatic cells in DHI milk samples is expected to improve the characterisation of the immunological ability of mammary defence. The aim of the first trial was to estimate whether the cell differentiation and the cell viability of composite milk samples represent a diagnostic tool for a predictive evaluation of mammary cure. If a cow suffers from a clinical mastitis, the assessed cell characteristics of the previous DHI test ought to assist in the estimation of mastitis prognosis. In this way, the identification of mammary glands, which will not benefit from antibiotic medication, should be improved.

The composite milk samples were analysed by flow cytometry to assess the proportion of highly granulated cells such as macrophages and polymorphonuclear leukocytes and the cell viability. Following this, the relationship between these parameters and the individual cytological cure was investigated. If an animal developed a clinical mastitis after the flow cytometric analysis, it was included in a second part of the study to assess the bacteriological cure and analyse its association to the flow cytometric parameters. The investigation concludes that the proportion of non-vital cells in DHI milk samples is significantly associated with the cytological cure of the mammary gland. A high amount of non-vital cells is correlated with a lower cytological cure. In this study no relation was observed between the highly granulated cells and the mammary cure. Also, the results displayed no connection between the cell parameters and the bacteriological cure of the mammary gland.

In conclusion, the proportion of non-vital cells in DHI milk samples has a prognostic validity for mammary cure. Therefore, it is possible to evaluate if a mammary gland will significantly benefit from an antibiotic medication. On this basis, the investigation of the cell viability in composite milk samples can be integrated in the standardised diagnostics of the DHI test. However, it should be noticed that the cell differentiation and the analysis of the cell viability are influenced by numerous environmental- animal- and pathogen specific effects which can impede the predictive value for mammary cure. The investigation of the bacteriological cure considering a pathogen specific classification was not integrated in this study, but it could provide promising results.

In the second part of the study a flow cytometric procedure was developed using non-centrifuged milk. Subsequently, this rapid method was checked for a predictive value for mammary cure with the aim to include this tool in the standardised diagnostics of the DHI test. Most studies use centrifugation to isolate the cell pellet, because milk fat and –proteins impede the flow cytometric measurement. A simplification of the cell preparation is required, because the laboratories analyse hundreds of samples per day. The aim of the second part of the study was to develop a rapid method which is easy to perform, needs less consumable material and has a high test accuracy.

During the pre-examinations testing various milk dilutions autofluorescent milk ingredients were illustrated in low fluorescent ranges in all wavelength ranges. In order to differentiate these artefacts from somatic cells it requires high fluorescing staining solutions. In this study the staining solution propidium iodide met the requirements, because of its high fluorescing complex with non-vital cells. However, its complex with vital cells is only emitting low fluorescences which is why these cells were illustrated together with autofluorescing particles. Hence, the quantification of vital cells was not achieved by the flow cytometric method, the cell count was measured by a fluoro-opto electronic counter (SomaScope Smart) and the proportion of non-vital cells was calculated. The statistics could identify significant, but low correlations between the methods with and without centrifugation. However, the predictive evaluation of the cytological and bacteriological cure was not achieved on the basis of the proportion of non-vital cells in DHI milk samples. The rapid method for investigation of the cell viability in non-centrifuged milk samples did not approve to gain a predictive value of mammary cure. The acquisition of vital and non-vital cells within one method and the usage of adjusted staining solutions appears to be relevant for a higher test accuracy.

keywords

Zelldifferenzierung, Milch, Eutergesundheit ; cell differentation, milk, udder health

kb

1.206