Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Katrin Bundkirchen

Mechanismen der Frakturheilung und Knochenregeneration nach Trauma-Hämorrhagie im murinen Tiermodell

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-110370

title (eng.)

Mechanisms of fracture healing and bone regeneration after trauma-hemorrhage in a murine model

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2017

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bundkirchenk_ws17.pdf

abstract (deutsch)

Femurfrakturen in Kombination mit schweren Blutverlusten nach Unfällen stellen sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin eine große Problematik dar, da sie häufig zu gestörter Frakturheilung - verzögerte Heilung und Pseudarthrosen - führen können. Da die Pathomechanismen noch nicht hinreichend bekannt sind, war das Ziel dieser Studie, sowohl die biomechanischen und histologischen Eigenschaften während der Frakturheilung als auch die beteiligten Signalwege in einem murinen Modell zu analysieren.

Zwar gibt es schon einige Studien, die sich mit der Auswirkung eines hämorrhagischen Schocks auf die Frakturheilung beschäftigt haben, allerdings führten diese zu widersprüchlichen Ergebnissen und wiesen oft methodische Einschränkungen wie eine schlechte Standardisierbarkeit und Reproduzierbarkeit auf. Weiterhin sind die hier zugrunde liegenden Signalwege bis heute unerforscht.

Vor diesem Hintergrund war es das Ziel dieser Studie, die Effekte einer Trauma-Hämorrhagie auf die Heilung von Femurfrakturen in einem standardisierten Maus-Modell über eine Zeitperiode von 6 Wochen mittels Radiologie und Biomechanik, Histologie und Analysen der beteiligten Signalwege zu untersuchen.

Für diese Studie wurden männliche C57BL/6N-Mäuse randomisiert auf fünf Gruppen zu fünf verschiedenen Zeitpunkten von 1, 2, 3, 4 oder 6 Wochen aufgeteilt (n = 3 - 10 Mäuse pro Gruppe und Zeitpunkt). Von jeder Maus wurde lediglich der rechte Femur für die Analysen benutzt: die Trauma-Hämorrhagie-Gruppe (TH) wurde einem Blutdruck-kontrollierten hämorrhagischen Schock via Katheter unterzogen; die Osteotomie-Gruppe (Fx) erhielt einen externen Fixateur und eine anschließende Osteotomie am rechten Femur; die kombinierte Trauma-Gruppe (THFx) erhielt sowohl einen hämorrhagischen Schock als auch eine Osteotomie nach Einbringen eines externen Fixateurs; bei der Sham-Gruppe wurde ein Katheter und ein externer Fixateur eingebracht, aber es wurde weder ein Blutentzug noch eine Osteotomie durchgeführt; die Kontroll-Gruppe wurde keinen operativen Eingriffen unterzogen. Für die Radiologie und Biomechanik wurden die Knochen mittels Röntgen, µCT und Drei-Punkt-Biegetest untersucht. Die nicht dekalzifizierte Histologie wurde mittels Technovit 9100-Schnitten durchgeführt, welche aufgrund unterschiedlicher Fragestellungen sowohl ungefärbt (Fluoreszenz) als auch gefärbt (Von Kossa, Pentachrom, TRAP) analysiert wurden. Die beteiligten Signalwege wurden lokal anhand von Callusmaterial mittels PCR und Western Blot und systemisch im ELISA anhand von Plasma analysiert. Die statistische Signifikanz wurde auf eine Wahrscheinlichkeit von unter 0,05 festgesetzt. Vergleiche wurden mittels Mann-Whitney-U- (Fx vs. THFx zum gleichen Zeitpunkt) oder Kruskal-Wallis-Test (andere Gruppen und/oder verschiedene Zeitpunkte) durchgeführt.

Nach einer Woche war die Fraktur in allen Tieren stets nicht stabil überbrückt, weshalb diese Knochen lediglich zur Signalweganalyse benutzt werden konnten, da sowohl für die Radiologie und Biomechanik als auch für die Histologie stabile Knochen benötigt wurden. Nach 2 Wochen lag bei allen Fx-Tieren makroskopisch und radiologisch eine mögliche Überbrückung vor, während die Knochen der THFx-Tiere in einem Drittel der Fälle nicht überbrückt waren, was jedoch keine signifikante Veränderung darstellte. Ab 3 Wochen nach der Operation waren die Knochen aller Tiere stabil überbrückt. Im µCT konnte gezeigt werden, dass eine Trauma-Hämorrhagie nach 2 Wochen zu einer signifikant verminderten Dichte des Knochens inklusive Callus und zu einem signifikant erhöhten Anteil des Callus/Volumen Knochenmasse nach Femurfraktur führte. Weiterhin zeigte der Drei-Punkt-Biegetest eine signifikante Abnahme des maximalen Biegemoments, der Steifigkeit und der Biegesteifigkeit in der Gruppe THFx im Vergleich zur Gruppe Fx nach 2 Wochen. Da sich in den biomechanischen Untersuchungen keine Unterschiede zwischen den Kontrollgruppen (Kontrolle, Sham, TH) oder nach 3, 4 oder 6 Wochen mehr ergaben, wurden für die Histologie weniger Sham- und TH-Tiere sowie keine 6 Wochen-Tiere mehr untersucht. Es wurden jedoch weiterhin 3 und 4 Wochen-Tiere benutzt, da die Histologie Unterschiede in der Callus-Zusammensetzung zu diesen Zeitpunkten aufzeigen könnte, welche in den biomechanischen Analysen nicht aufgedeckt werden konnten. Die histologischen Untersuchungen ergaben in der Auswertung der Von Kossa-gefärbten Schnitte einen signifikant verminderten mineralisierten Knochen nach 2 Wochen für die Gruppe THFx im Vergleich zur Gruppe Fx. Die Auswertung der Pentachrom-Schnitte zeigte einen signifikant geringeren Knorpelanteil nach 2 Wochen in der THFx-Gruppe im Vergleich zur Fx-Gruppe. Die Fluoreszenzanalysen stellten eine verminderte Knochenbildung in der letzten Woche vor Tötung in den 3 Wochen-Tieren der THFx-Gruppe im Gegensatz zur Fx-Gruppe heraus. Die Analysen der Signalwege, welche nur mit Knochen der frühen Zeitpunkte 1 und 2 Wochen durchgeführt wurden, zeigten eine Aktivierung des RANKL/OPG- und IL6-Signalwegs.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass anhand dieser Studie gezeigt werden konnte, dass eine Trauma-Hämorrhagie einen negativen Effekt auf die frühe Phase der Frakturheilung hat.

abstract (englisch)

Femoral fractures in combination with a severe blood loss after accidents are a big problem in both human and veterinary medicine because they often lead to impaired fracture healing - delayed healing and non-unions. As the underlying pathogenesis remains poorly understood, the study aims to analyze the biomechanical and histological properties during fracture healing, as well as the involved signaling pathways in a murine model.

Although there are some studies concerning the effect of a hemorrhagic shock on fracture healing the results are conflicting and the studies show some methodical limitations like unreliable standardization or reproducibility. Moreover the underlying signaling pathways are still unexplored.

Against this background, the aim of this study was to evaluate the effect of trauma-hemorrhage on the healing of femoral fractures in a standardized mouse model over a period of six weeks via radiology and biomechanics, histology and analysis of the influenced signaling pathways.

Male C57BL/6N mice were randomly assigned to five groups and five different times of 1, 2, 3, 4 or 6 weeks (n = 3 - 10 mice per group and time). From each mouse only the right femur was used for analysis: the trauma hemorrhage (TH) group received a pressure controlled hemorrhagic shock via catheter; the osteotomy (Fx) group underwent implantation of an external fixator and osteotomy onto the right femur; the combined trauma (THFx) group received hemorrhagic shock and an external fixator with following osteotomy; the sham group underwent implantation of a catheter and external fixator but neither blood loss nor osteotomy; the control group underwent no interventions. For radiology and biomechanics bones were evaluated via X-ray, µCT and three-point-bending test. The nondecalcified histology was analyzed via Technovit 9100 slices, which were due to different questioning unstained (fluorescence) or stained (Von Kossa, Pentachrom, TRAP). The underlying signaling pathways were analyzed locally on the basis of callus material via PCR and Western Blot and systemically via ELISA on the basis of plasma. Statistical significance was set at a probability less than 0.05. Comparisons were performed using the Mann-Whitney-U (Fx vs. THFx at the same time) or the Kruskal-Wallis test (other groups and/or different times).

After one week the fracture was not stable bridged in all animals, therefore these bones were only be usable for analysis of the signaling pathways, as stable bones were a necessity for both the biomechanics and the histology. After 2 weeks all Fx-bones showed a macroscopic and radiological possible bridging whereas one third of the bones of the THFx-animals were not bridged, which though represented no significant change. From 3 weeks on the bones of all animals were stable bridged. The µCT-analyzes showed that trauma-hemorrhage leads to a significantly decreased density of bone including callus and to a significantly increased share of callus per volume of bone mass after femoral fracture. Furthermore the three-point-bending test showed a significant decrease of the maximum bending moment, the stiffness and the bending stiffness in the group THFx in comparison to the group Fx after 2 weeks. As there were no differences in biomechanical analyzes between the control groups (Control, Sham, TH) or after 3, 4 or 6 weeks the histology was made of less Sham- and TH-animals and no 6 weeks animals were used here. Nevertheless, animals after 3 and 4 weeks were used because the histology might show differences in callus composition for these times which were not observable via biomechanical analysis. The histology resulted in a significantly reduced share of bone shown by the Von Kossa staining after 2 weeks for the group THFx compared to the group Fx. The evaluation of the Pentachrom slices determined significant less cartilage after 2 weeks in the group THFx in contrast to the Fx group. The results of the fluorescence demonstrated a decreased amount of new bone in the last week before killing in the 3 week animals of the THFx group in comparison to the Fx group. The analyzes of the signaling pathways, which were conducted with bones of the early times 1 and 2 weeks, determined an activation of the RANKL/OPG and IL6 signaling pathway.

In summary, this in vivo mouse fracture model determined that a hemorrhagic shock retards fracture healing during the early phase of the fracture healing process.

keywords

Trauma-Hämorrhagie, Blutverlust, Femurfraktur ; trauma-hemorrhage, blood loss, femoral fracture

kb

5.458