Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 

 Stephanie Buchheister

 

 Einfluss von Cd14 auf die intestinale Homöostase und den Verlauf von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen im Mausmodell

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107882

title (engl.)

Influence of Cd14 on the intestinal homeostasis and the course of inflammatory bowel disease in mouse colitis models

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/buchheisters_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen, mit den humanen Haupterkrankungsformen Morbus Crohn (MC) und Colitis Ulcerosa (CU), sind rezidivierende Entzündungen des Gastrointestinaltraktes. Obwohl die genaue Pathogenese der Erkrankungen bislang noch unbekannt ist, gilt ein Zusammenbruch intestinaler Barrieremechanismen als Schlüsselfaktor innerhalb der Entwicklung von CED. Im experimentellen Kolitismodell der Interleukin 10 (Il10)-defizienten Maus ist der jeweilige Krankheitsverlauf abhängig vom Hintergrundstamm der Tiere. Während Mäuse des Stammes C3H/HeJBir hochempfänglich für die Entwicklung einer Kolitis sind, zeigen Mäuse des Stammes C57BL/6J einen wesentlich milderen Verlauf einer Darmentzündung in diesem Modell. Durch genetische Analysen an Kreuzungspopulationen aus diesen Stämmen wurden insgesamt zehn „quantitative trait loci“ (QTL) beschrieben, die als „Cytokine-deficiency-induced-colitis-susceptibility“ (Cdcs)-Loci bezeichnet werden. Innerhalb des Cdcs6 Locus auf Chromosom 18 wurde Cd14 als krankheitsmodulierendes Kandidatengen identifiziert. Vorarbeiten zeigten eine höhere Empfänglichkeit Cd14-defizienter Mäuse für eine Dextran-Natrium-Sulfat (DSS)-induzierte Kolitis. Im humanen Bereich konnten Promotorpolymorphismen des Cd14-Gens mit einem erhöhten Krankheitsrisiko für MC und CU assoziiert werden. Ziel dieser Doktorarbeit war es, den Einfluss von Cd14 auf den Verlauf experimenteller Darmentzündungen, v.a. im Hinblick auf intestinale Barrieremechanismen, zu untersuchen. Hierbei sollten sowohl epitheliale als auch immunologische Funktionen der Darmbarriere charakterisiert werden.

Um einen möglichen Einfluss einer Cd14-Defizienz auf diese Parameter zu untersuchen, wurden Cd14-defiziente Tiere (B6-Cd14-/-) sowohl unter nicht entzündlichen Bedingungen als auch im akuten DSS-induzierten Kolitismodell untersucht. Weiterhin wurden im chronischen Il10-/- Kolitismodell Cd14-/-Il10-/- doppeltdefiziente Mäuse (B6-DKO) analysiert. Im Zusammenhang mit einer möglichen Protektion durch CD14 kamen transgene Mäuse zum Einsatz (B6-Tg-Cd14), bei denen durch die orale Gabe von Zinksulfat eine Cd14-Überexpression induziert wurde. Zunächst wurde die intestinale Permeabilität in vivo durch die Detektion oral verabreichten Fluoreszein-Iso-Thiocyanat-(FITC)-Dextran im Urin der Tiere bestimmt. Des Weiteren wurde die Genexpression der Tight-Junction (TJ) Proteine Occludin (Ocln), Zonula-occludens-Protein-1 (Zo-1) und Claudin 4 (Cldn4) per quantitativer Real Time Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) untersucht. Weiterhin wurden immunhistologische Färbungen für Occludin und die Bestimmung der intestinalen Apoptose- und Proliferationsraten durch TUNEL- und Ki67 Färbung durchgeführt. Zur Charakterisierung immunologischer Parameter wurden histologische Untersuchungen des Dickdarms und die Genexpression der proinflammatorischen Zytokine Tumor-Nekrose-Faktor alpha (Tnfα) und Interferon gamma (Ifnγ) per qRT-PCR vorgenommen. Zur Untersuchung der T-zellabhängigen Immunantwort wurden Lymphozytenkulturüberstände der Mesenteriallymphknoten hinsichtlich ihres sezernierten Zytokinmusters per Multiplex Analyse bestimmt. Abschließend wurden innerhalb eines T-Zelltransfermodells sowohl naive Wildtypzellen in immunsupprimierte B6-Cd14-/-Rag1-/- doppeltdefiziente Mäuse als auch naive T-Zellpopulation aus Cd14-/- und WT Spendertieren in B6-Rag1-/- Mäuse transferiert. In diesem Modell wurde der Verlauf der Transferkolitis in vivo durch magnetresonanztomographische Bildgebung (MRT) untersucht und die Darmentzündung wurde final durch histologische Untersuchung analysiert.

Cd14-defiziente Tiere zeigten unter basalen Bedingungen keine Unterschiede hinsichtlich der untersuchten epithelialen und immunologischen Funktionen zu den Wildtypkontrollen. Im akuten und chronischen Kolitismodell hingegen führte eine Cd14-Defizienz zu einer signifikant höheren intestinalen Permeabilität in vivo und zu einer signifikant geringeren Expression der TJ-Proteine. Ferner waren sowohl die Apoptoserate intestinaler Epithelzellen als auch die Proliferationsrate intestinaler Lamina Propria Zellen erhöht. Des Weiteren wiesen Cd14-defiziente Tiere in beiden Kolitismodellen eine stärkere Entzündung von Zäkum und Kolon und eine signifikant höhere Genexpression proinflammatorischer Zytokine auf als die entsprechenden Wildtypen. Eine Cd14-Überexpression konnte im akuten Kolitismodell einen DSS-induzierten Permeabilitätsanstieg des Darmepithels verhindern und führte zu einer signifikant höheren Occludin Expression im Vergleich zur Kontrollgruppe. Ferner war ein signifikant geringerer histologischer Score und eine verringerte Expression proinflammatorischer Zytokine bei Cd14-überexprimierenden Tiere unter DSS-Gabe zu beobachten als bei Kontrolltieren. Innerhalb des Transferkolitismodells konnte kein eindeutiger Effekt einer Cd14-Defizienz auf den Verlauf einer Darmentzündung gezeigt werden. Die Untersuchungen der Lymphozytenkulturüberstände ergaben allerdings Hinweise auf eine Cd14-abhängige Entwicklung von T-Zellpopulationen durch eine deutlich geringere Zytokinsekrektion Cd14-defizienter Zellen im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen sowohl unter basalen als auch unter entzündlichen Bedingungen.

Zusammenfassend konnte in dieser Doktorarbeit insgesamt ein protektiver Einfluss von Cd14 auf den Verlauf experimenteller Darmentzündungen im Mausmodell gezeigt werden. Cd14 wirkt hier zum einen über eine Erhöhung der epithelialen Barrierefunktion und zum anderen über antiinflammatorische Modulation des inflammatorischen Geschehens. CD14 könnte somit einen attraktiven Kandidaten eines neuartigen Therapieansatzes für humane CED darstellen.

 

abstract (englisch)

Inflammatory bowel disease (IBD), with the two main manifestation forms Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) in humans, is characterised by relapsing inflammation of the gut. Although the pathogenesis of the disease still remains unknown, intestinal barrier disruption likely plays a key role in the IBD development. In an experimental mouse colitis model based on Interleukin-10 (Il10)-deficiency, the severity of the disease development depends on the strain background. Mice on a C3H/HeJBir background are highly susceptible for the development of colitis, while mice on a C57BL/6J background are rather resistant to the development of intestinal inflammation. Quantitative trait locus analyses revealed 10 “cytokine-deficiency induced colitis susceptibility” (Cdcs) loci. The Cd14-gene is located within the Cdcs6 locus on mouse chromosome 18 and was identified as a major candidate gene for modifying colitis development. In previous studies Cd14-deficient mice showed a higher susceptibility for dextran-sodium-sulfate (DSS)-induced colitis. Additionally, polymorphisms in the promotor region of the human Cd14-gene were associated with a higher risk for the CD and UC development. The aim of this study was to elucidate the role of Cd14 for the development of experimental colitis in particular with regard to intestinal barrier mechanisms. Therefore epithelial as well as immunological factors were investigated.

Cd14-deficient mice (B6-Cd14-/-) were analyzed under steady state conditions as well as in an acute DSS-induced colitis model. In a chronic colitis model based on Il10-deficiency Cd14-/-Il10-/- double-deficient mice (B6-DKO) were investigated. Protective mechanisms of CD14 were analyzed using transgenic mice, in which overexpression of Cd14 was induced by oral administration of zinc sulfate. The intestinal permeability was analyzed in vivo by measurement of fluorescence-iso-thiocyanate (FITC)-dextran in the urine after oral gavage. Furthermore, gene expression of the tight junction (TJ) proteins occludin (Ocln), zonula-occludens-protein 1 (Zo-1) and claudin 4 (Cldn4) was assesed by quantitative realtime polymerase chain reaction (qRT-PCR). Moreover, immunohistological staining of occludin and measurement of the intestinal apoptosis- and proliferation rate by TUNEL- and Ki67-staining were performed. Immunological parameters were characterized by histological examination of the large bowel and expression of proinflammatory cytokines such as tumor necrosis factor alpha (Tnfα) and interferon gamma (Ifnγ) which were quantified by qRT-PCR. Multiplex analysis was utilized to evaluate the T-cell dependent immune response by measuring the cytokine expression in the supernatants of mesenteric lymphocyte cultures. Finally T-cell transfer experiments were done by transferring naïve wildtype T-cells into immunocompromised B6-Cd14-/-Rag1-/- double-deficient mice and wildtype and Cd14-/- naïve T-cells into B6-Rag1-/- mice. In this model the development of colitis was analyzed in vivo by magnetic resonance tomographic based imaging (MRI) and histological scoring.

Under steady state conditions B6-Cd14-/- mice showed no differences compared to wildtype controls concerning epithelial and immunological functions. However, in the acute and chronic colitis model the intestinal permeability in vivo was significantly increased, the TJ expression was significantly decreased and the intestinal cell apoptosis- and proliferation rates were both significantly increased in Cd14-/-mice compared to the control groups. Furthermore, histological examination and proinflammatory cytokine expression revealed a significantly higher intestinal inflammation score in the Cd14-deficient mice compared to the controls in both models of colitis. Moreover, overexpression of Cd14 was able to prevent the DSS-induced increase of intestinal permeability and led to significantly increased occludin expression compared to the controls. CD14 displayed a protective anti-inflammatory effect through a significantly lower histological score and decreased proinflammatory cytokine expression in the DSS-treated Cd14-overexpressing mice. Although the T-cell transfercolitis model did not reveal an univocal effect of a Cd14-deficiency, decreased cytokine secretion of Cd14-deficient cells under steady state as well as under inflammatory conditions indicated a Cd14-dependent development of T-cell populations.

Altogether our results demonstrated a protective influence of Cd14 on the development of experimental colitis. Cd14 was able to modulate the inflammatory process by antiinflammatory effects as well as by tightening the intestinal epithelial barrier. CD14 could therefore be considered as an attractive new therapeutic target for the treatment of human IBD.

 

keywords

CD14, Chronisch entzündliche Darmerkrankungen, intestinale Homöostase, CD14, Inflammatory Bowel Disease, intestinal homeostasis

kb

12.601