Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Graham Brogden

 

Cell-pathogen interactions in common carp (Cyprinus carpio L.): Studies on cell membranes and neutrophil responses

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103723

title (ger.)

Zell-Pathogen Interaktionen in Karpfen (Cyprinus carpio L.): Studien an Zellmembranen und Reaktionen neutrophiler Granulozyten

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/brogdeng_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Ziel dieser Studie war, Interaktionen der Wirts-Erreger Beziehung auf Zellebene am Karpfenmodell zu erforschen. Es sollte dargelegt werden, wie der Futtermittelzusatzstoff β-Glukan den Verlauf einer Infektion durch die Modulation der Bildung, Stabilisierung und die bakteriziden Fähigkeiten der NETs während einer Infektion mit Aeromonas hydrophila beeinflussen kann. Zusätzlich sollten die Mechanismen, die hinter der NET Bildung stehen, und die Rolle des Cholesterols bei dieser Immunreaktion untersucht werden. Des Weiteren sollte eine Methode etabliert werden, mit der die Lipidzusammensetzung der Zellmembran von Karpfen zu untersucht werden kann, um die Rolle von Lipid Rafts beim Eintritt des CyHV-3 in die Zelle zu prüfen.

In Kapitel 2 wurde der Effekt von β-Glukan auf NET Bildung und die Rolle von NETs auf Aeromonas hydrophila beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, dass die NET Bildung sowohl von der β-Glukan Konzentration als auch von der Zeit abhängig ist. Darüber hinaus zeigten wir, dass NETs von Karpfen zwar dazu fähig sind A. hydrophila einzuschließen, aber nicht in der Lage sind diese Bakterien abzutöten. Auch wurde der prozentuale Anteil von eingeschlossenen Bakterien bei Anwesenheit von β-Glukan gesteigert. Interessanterweise waren neutrophile Granulozyten, die aus der Rumpfniere isoliert wurden, in der Lage einen höherer Anteil von NETs zu produzierte, als neutrophilen Granulozyten, die aus der Kopfniere isoliert wurden.

In Kapitel 3 untersuchten wir die Wechselbeziehung zwischen Karpfen NETs und einem pathogenen A. hydrophila Stamm. Wie wir im Vorfeld gezeigt haben, kann A. hydrophila in den Protein-DNA-Komplexen (NETs) von neutrophilen Granulozyten eingeschlossen werden. Weiterhin konnten wir zeigen, dass A. hydrophila in der Lage ist, DNA abbauende Nukleasen zu produzieren, um NETs von Karpfen zu zerstören. Interessanterweise zeigte sich so, dass der Zusatz von β-Glukanen die NETs gegenüber den Bakterien in vitro stabilisiert.

In Kapitel 4 wurde die Rolle des Cholesterols in der NET Bildung beschrieben. Diese Untersuchung wurde aufgrund der begrenzten Möglichkeiten neutrophile Granulozyten von Karpfen zu nutzen, mit neutrophilen Granulozyten aus humanem peripherem Blut durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass MβCD-induzierte Cholesteroldepletion zu einer gesteigerten NET Produktion führte. Die Behandlung mit dem Sphingolipid-Synthese-Inhibitor NB-DNJ hat bedeutenderweise keinen Effekt auf die NET Produktion. Zusätzlich zeigte sich, dass die MβCD-induzierte NET Produktion interessanterweise ROS unabhängig war. Demzufolge zeigten die Ergebnisse, das Cholesterol eine signifikante Rolle in den Mechanismen zur NET Produktion spielt.

Da wir bereits die Bedeutung der Lipide, insbesondere Cholesterol, in Immunreaktionen dargestellt haben, wollten wir die Lipidkomposition in Zellmembranen von Karpfen charakterisieren. Daher etablierten wir ein Protokoll zur Isolierung und Analyse von Membranlipiden und Lipid Rafts, wonach Membranfraktionen mit Triton X-100 isoliert wurden und die Lipidzusammensetzung durch Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) visualisiert wurde. Die Methode wurde durch Westernblot validiert, welches eine hohe Konzentration des Lipid Rafts assoziierten Flotillin Proteins in der Lipid Raft Fraktion zeigte. Höhere Konzentrationen von Cholesterol, freien Fettsäuren, Triglyceriden und Sphingomyelin wurden in den Lipid Raft Fraktionen detektiert, während in der DSM Fraktion höhere Konzentrationen von Phospholipiden gefunden wurden.

Schließlich wollten wir mithilfe der Cholesterolreduzierung und der Fettsäureanalyse, die in dieser Arbeit beschrieben werden, die Rolle von Lipid Rafts während einer CyHV-3 Infektion untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass nach einer Cholesterol-Depletionsbehandlung mit MβCD von CCB-Zellen, der Viruseintritt verhindert wurde. Dies wurde durch ein geringeres Level von Viruskopien gekennzeichnet. Untersucht wurde dies durch qRT-PCR und Immunhistochemie.

Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse, die in dieser Studie vorgestellt wurden, die Wirt-Pathogen Interaktionen während einer bakteriellen und einer viralen Infektion. Weiterhin können die hier vorgestellten Methoden für detailgenauere Studien der Wirt-Pathogen Interaktion genutzt werden und die erhaltenen Erkenntnisse können bei der Identifizierung neuer Ziele der Infektionsabwehr für neue Behandlungsmöglichkeiten oder prophylaktische Strategien in der Aquakultur genutzt werden.

abstract (englisch)

The aim of this study was to investigate host-pathogen interactions at the cell level in common carp.  We wanted to investigate and describe how the feed additive β-glucan can improve the outcome of an infection by modulating the formation, stabilisation and bactericidal ability of NETs when exposed to Aeromonas hydrophila.  Additionally, we wanted to explore the mechanisms behind NET formation and the role of cholesterol in this immune reaction.  Furthermore, we wanted to establish a method to investigate the lipid composition of a carp cell membrane and to ascertain the role of cholesterol-rich lipid rafts in CyHV-3 entry into a cell. 

In chapter 2, we described the effects of β-glucan on NET formation and the role of NETs against Aeromonas hydrophila.  The results show that NET formation is both time and β-glucan concentration dependent. Furthermore, we showed that carp NETs are capable of entrapping but not killing A. hydrophila and that the percentage of entrapped bacteria was increased in the presence of β-glucan.  Interestingly, a higher percentage of neutrophils isolated from the kidney produced a NET compared to head kidney derived neutrophils.  Similarly, kidney derived neutrophils were also able to entrap a higher percentage of bacteria relative to head kidney derived neutrophils.

Additionally, in chapter 3 we investigated the interaction between carp NETs and a pathogenic strain of A. hydrophila.  As we showed previously that A. hydrophila can be trapped in the protein-DNA NET complexes released from carp neutrophils, we demonstrated that A. hydrophila is able to produce DNA degrading nucleases which were shown to destroy carp NETs.  Importantly, the addition of β-glucan in vitro stabilised the NETs against the host-evasion strategy employed by the bacteria.

In chapter 4 we described the role of cholesterol in the formation of NETs.  This work was performed using human peripheral blood derived neutrophils due to the limitations of using carp neutrophils.  The results show that MβCD-induced cholesterol depletion led to an increase in NET production.  Importantly, treatment with the sphingolipid synthesis inhibitor NB-DNJ had no effect on NET production. Interestingly, MβCD-induced NET production was also shown to be ROS independent.  Therefore, these results show that cholesterol plays a significant role in mechanism leading to NET production.

As we have shown the importance of lipids and particularly cholesterol in immune functions, we wanted to characterise the lipid composition of the cell membrane in carp (chapter 5).  Therefore, a lipid raft isolation and analysis protocol was established, whereby lipid rafts were isolated with Triton X-100 and the lipid composition visualised by using high performance thin layer chromatography. The method was validated by western blotting which showed high concentrations of the lipid raft associated flotillin protein in the lipid raft fraction.  Higher concentrations of cholesterol, free fatty acids, triglycerides and sphingomyelin were detected in lipid rafts fractions, whereas higher concentrations of phospholipids were detected in the DSM fraction.

Lastly, using the cholesterol reduction and lipid analysis methods described in this thesis, we wanted to investigate the role lipid rafts play during a CyHV-3 infection (chapter 6).  The results showed that after cholesterol-depleting MβCD treatment of CCB cells, virus entry was hindered, which was determined by lower levels of virus replication and virus copies evaluated by qRT-PCR and immunocytochemistry respectively.

Taken together, the results presented in this thesis have characterised host-pathogen interactions during bacterial and viral carp infections. Furthermore, methodologies presented here can be used for more detailed studies of host-pathogen interactions and the knowledge gained can help to identify novel targets against infections for new treatment or prophylactic strategies in fish aquaculture.

keywords

Neutrophil exracellular traps, Lipid Rafts, Karpfen, common carp

kb

2.366