Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Geovana Brenner Michael

Molecular analysis of a

multi-resistant bovine Pasteurella multocida

strain from the U.S.A.

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106243

title (ger.)

Molekulare Analyse eines multi-resistenten Pasteurella multocida-Stammes boviner Herkunft aus den U.S.A.

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/brennamichaelg_ss15.pdf

abstract (deutsch)

In der vorliegenden Dissertation wurde ein multi-resistenter Pasteurella multocida-Stamm von einem an einer Atemwegsinfektion erkrankten Rind aus den U.S.A. hinsichtlich seiner Genomstruktur und den genetischen Grundlagen der Multi-Resistenz untersucht. Ein besonderer Schwerpunkt der Arbeiten war die Identifizierung neuer Gene für Resistenz gegenüber Makroliden und Triamiliden. Vertreter dieser beiden Wirkstoffklassen werden häufig bei Atemwegsinfektionen von Rindern eingesetzt und die Grundlagen der Resistenz gegenüber Makroliden und Triamiliden bei entsprechenden Erregern waren weitgehend unbekannt.

Für diese Dissertation wurde der repräsentative P. multocida-Stamm 36950 ausgewählt. Da PCR-basierte Suchen nach bekannten erm-Genen sowie Transformationsexperiemnte keine Erfolge zeigten, wurde P. multocida 36950 einer Gesamtgenomsequenzierung unterzogen. Die Untersuchung der dabei erhaltenen Contigs führte zur Identifizierung des neuen rRNA-Methylase-Gens erm(42), des Makrolid-Transportergens msr(E) und des Makrolid-Phosphotransferasegens mph(E). Funktionelle Klonierung und Expression dieser Gene in einem makrolidempfindlichen P. multocida-Empfängerstamm bestätigten, dass erm(42) in erster Linie Resistenz gegenüber Tilmicosin und Linkosamiden wie Clindamycin vermittelte, aber die minimale Hemmkonzentration (MHK) für Tulathormycin nur leicht erhöhte. Im Gegensatz dazu vermittelten die Gene msr(E)-mph(E) Resistenz gegenüber Tilmicosin und Tulathromycin, hatten aber keinen Effekt auf die MHK-Werte für Linkosamide. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen klärten erstmalig die genetischen Grundlagen der Resistenz gegenüber Makroliden, Triamiliden und Linkosamiden bei P. multocida [Chapter 2].

Weitere Untersuchungen der Genomsequenz von P. multocida 36950 sowie Vergleiche mit anderen Genomen zeigten, dass die drei vorab identifizierten Resistenzgene Bestandteil eines mobilen genetischen Elements, des integrativen und konjugativen Elements ICEPmu1, waren. ICEPmu1 ist das erste bei P. multocida jemals beschriebene ICE [Chapter 3]. Zusätzlich zu den drei Makrolid/Triamilid-Resistenzgenen trägt ICEPmu1 noch weitere neun Resistenzgene. Elf der insgesamt 12 Resistenzgene vermitteln Resistenz gegenüber Streptomycin (strA und strB), Streptomycin/Spectinomycin (aadA25), Gentamicin (aadB), Kanamycin/Neomycin (aphA1), Tetrazyklin [tetR-tet(H)], Chloramphenicol/Florfenicol (floR), Sulphonamiden (sul2), Tilmicosin/Clindamycin [erm(42)] oder Tilmicosin/Tulathromycin [msr(E)-mph(E)]. Zusätzlich wurde ein komplettes β-Laktamasegen, blaOXA-2, nachgewiesen, welches aber bei P. multocida funktionell inaktiv zu sein scheint. Alle diese Resistenzgene waren in zwei Regionen von etwa 15.7 und 9.8 kb Größe organisiert. Resistenz gegenüber dem Chinolon Nalidixinsäure und dem Fluorchinolon Enrofloxacin basierte auf Punktmutationen in der Chinlonresistenz-vermittelten Region der Gene gyrA und parC [Chapter 3]. Solch ein umfassender Multi-Resistenzphänotyp wurde bislang selten bei P. multocida und anderen bovinen Atemwegsinfektionserregern beobachtet. Die nachgewiesenen Resistenzgene und resistenzvermittelnden Mutationen erklären vollständig den nachgewiesenen Multi-Resistenzphänotyp [Chapter 3].

Das 82.214 bp große ICEPmu1 besitzt insgesamt 88 Gene. Die Gene von ICEPmu1, deren Genprodukte in Prozesse wie Exzision/Integration und konjugativer Transfer beteiligt sind, ähneln denen, die bei einem 66.641 bp großen ICE von Histophilus somni gefunden wurden. ICEPmu1 integriert in eine tRNALeu und wird von 13 bp großen direkten Sequenzwiederholungen flankiert. ICEPmu1 überträgt sich durch Konjugation in andere Bakterien wie P. multocida, M. haemolytica und E. coli, wo es auch eine tRNALeu zur Integration nutzt und eng verwandte 13 bp große direkte Sequenzwiederholungen an der Integrationsstelle produziert. ICEPmu1 und seine zirkuläre Zwischenform wurden in den Transkonjuganden mittels PCR- und Sequenzanalysen bestätigt. PCR-Analysen und Empfindlichkeitsprüfungen zeigten dass die ICEPmu1-assoziierten Resistenzgene in den Transkonjuganden funktionell aktiv waren. Lediglich das Gen blaOXA-2 war in den P. multocida- und M. haemolytica-Transkonjuganden inaktiv, in dem E. coli-Transkonjugand jedoch aktiv [Chapter 4].

Die neuen Makrolid/Triamilid-Resistenzgene wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, auch Resistenz gegenüber Gamithromycin und Tildipirosin, zwei neuen Makroliden, die im Laufe dieses Dissertationsprojektes zugelassen wurden, zu vermitteln. Basierend auf den beobachteten Steigerungen der MHK-Werte für P. multocida B130-Klone, die die klonierten Gene erm(42) oder msr(E)-mph(E) trugen, vermittelt erm(42) in erster Linie Resistenz gegenüber Tildipirosin MIC (128-facher Anstieg des MHK-Werts) während in Gegenwart von msr(E)-mph(E) ein 256-facher Anstieg des MHK-Werts für Gamithromycin bei P. multocida B130 zu verzeichnen war. Diese Beobachtungen wurden durch die Untersuchung von P. multocida- und M. haemolytica-Feldisolate bestätigt, die die drei Resistenzgene in unterschiedlichen Kombinationen enthielten [CHAPTER 5].

ICEPmu1 ist in der Lage, sich über Stamm-, Spezies- und Genusgrenzen auszubreiten. Da es über 12 Resistenzgene verfügt, die zum Teil auch Resistenz gegenüber den neusten, für die Behandlung boviner Atemwegsinfektionen zugelassenen Wirkstoffen vermitteln, reduziert die Ausbreitung dieses ICEs drastisch die therapeutischen Optionen. Die Verbreitung von ICEPmu1 bei bovinen Atemwegsinfektionserregern wird als besondere Bedrohung in Bezug auf antimikrobielle Resistenz bei Infektionserregern Lebensmittel liefernder Tiere angesehen [Chapter 6].

abstract (englisch)

The present doctoral thesis aimed at investigating a multi-resistant Pasteurella multocida strain obtained from a case of bovine respiratory disease (BRD) in the U.S.A. for its genomic structure and the genetic basis of multi-resistance. Particular emphasis was put on the identification of novel genes that confer resistance to macrolides and triamilides as members from these classes are frequently used to combat BRD and the genetics of resistance to macrolides in BRD pathogens, including P. multocida, were largely unknown.

For this doctoral thesis, the representative P. multocida strain 36950 was chosen. Since PCR-directed searches for known erm genes as well as repeated transformation attempts were unsuccessful, P. multocida 36950 was subjected to whole genome sequencing. Contigs obtained from the draft genome led to the identification of a novel rRNA methylase gene erm(42), the macrolide transporter gene msr(E), and the macrolide phosphotransferase gene mph(E). Functional cloning and expression of these genes in a macrolide susceptible P. multocida recipient strain confirmed that erm(42) was mainly responsible for resistance to tilmicosin and lincosamides such as clindamycin and only slightly increased the minimal inhibitory concentrations (MICs) of tulathormycin. In contrast, msr(E)-mph(E) were responsible for resistance to tilmicosin and tulathromycin, but had no effect on the MICs of lincosamides. The results of this study described for the first time the molecular basis of macrolide, triamilide, and lincosamide resistance in P. multocida [Chapter 2].

Further analysis of P. multocida 36950 genome and genomic comparisons revealed that these three genes were located on a mobile genetic element, an integrative and conjugative element (ICE), designated ICEPmu1. It was also the first report of an ICE in P. multocida [Chapter 3]. In addition to the three macrolide/triami-lide resistance genes, another nine antimicrobial resistance genes were found to be part of ICEPmu1. Eleven of the 12 resistance genes conferred resistance to streptomycin (strA and strB), streptomycin/spectinomycin (aadA25), gentamicin (aadB), kanamycin/neomycin (aphA1), tetracycline [tetR-tet(H)], chloramphenicol/ florfenicol (floR), sulphonamides (sul2), tilmicosin/clindamycin [erm(42)] or tilmicosin/tulathromycin [msr(E)-mph(E)]. In addition, a complete β-lactamase gene blaOXA-2 was detected, which, however, appeared to be functionally inactive in P. multocida. These resistance genes were organized in two regions of approximately 15.7 and 9.8 kb. Furthermore, resistance to nalidixic acid and enrofloxacin was due to point mutations within the quinolone-resistance determining region (QRDR) of the genes gyrA and parC [Chapter 3]. Such an expanded multi-resistance phenotype has very rarely been observed in P. multocida and other bovine respiratory tract pathogens. And the resistance genes and resistance-mediating mutations detected could fully explain this multi-resistance phenotype [Chapter 3].

The 82,214 bp ICEPmu1 harbours 88 genes. The core genes of ICEPmu1, which are involved in excision/integration and conjugative transfer, resemble those found in a 66,641 bp ICE from Histophilus somni. ICEPmu1 integrates into a tRNALeu and is flanked by 13 bp direct repeats. It is able to transfer by conjugation to P. multocida, M. haemolytica and E. coli, where it also uses a tRNALeu for integration and produces closely related 13 bp direct repeats at the integration site. The presence of ICEPmu1 and its circular intermediate in the transconjugands was confirmed by PCR and sequence analysis. PCR assays and susceptibility testing confirmed the presence and the functional activity of the ICEPmu1-associated resistance genes in the transconjugands. The gene blaOXA-2 proved to be inactive in P. multocida and M. haemolytica recipients, but was functionally active in the E. coli recipient strain [Chapter 4].

The novel macrolide and triamilide resistance genes were tested for their ability to confer resistance to gamithromycin and tildipirosin, two novel macrolides approved during the course of this doctoral thesis. Based on the observed increases in the MIC values in P. multocida B130 carrying the cloned erm(42) or msr(E)-mph(E), it appears as if erm(42) has mainly an effect on the tildipirosin MIC (128-fold increase) whereas msr(E)-mph(E) increases the gamithromycin MIC 256-fold in P. multocida B130. These observations were confirmed with P. multocida and M. haemolytica field isolates that carried the three genes in different combinations [CHAPTER 5].

ICEPmu1 proved to move across species and genus boundaries and since it carries 12 resistance genes, some of which confer resistance to the most recently approved antimicrobial agents for treatment of BRD, its dissemination drastically limits the treatment options. As such, the spread of ICEPmu1 is considered an emerging issue in antimicrobial resistance of food-producing animals [Chapter 6].

keywords

Antimicrobial resistance – Macrolides – integrative and conjugative element, Antimikrobielle Resistenz – Makroliden – integrative und konjugative Element 

kb

2.947