Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Maria Daniela Brauneis

 

Entwicklung eines In-vitro-Testsystems zur Prüfung des kanzerogenen Potenzials von Chemikalien

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-104575

title (engl.)

Development of an in vitro test system for the analysis of the carcinogenic potential of chemicals

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/brauneism_ss14.pdf

abstract (deutsch)

Die Verwendung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch steht in der Prüfung und Risikobewertung von Chemikalien u. a. im Hinblick auf die gesetzliche Entwicklung der letzten Jahre zunehmend im Vordergrund. Der BALB/c-3T3-Zelltransformationstest und der Weichagar-Koloniebildungstest sind zwei bekannte In-vitro-Testverfahren zur Bestimmung des kanzerogenen Potenzials von Chemikalien. Mit Hilfe von Zelltransformationstests können in einem vereinfachten Modell verschiedene Phasen der Kanzerogenese simuliert und Veränderungen des zellulären Wachstums durch die Exposition mit verschiedenen potenziell kanzerogenen Chemikalien bestimmt werden. Dabei besteht der anhand der Bildung von Zellherden (Foci) ermittelte wachstumsassoziierte Endpunkt in einem Verlust der Zell-Zell-Kontaktinhibition. Ein Nachteil dieser Testsysteme ist jedoch, dass ihre metabolische Kapazität stark limitiert ist und somit die adäquate Prüfung von Prokanzerogenen nicht gewährleistet werden kann. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit zunächst zwei verschiedene exogene metabolisierende Systeme getestet, die mit dem BALB/c-3T3-Zelltransformationstest kombiniert wurden. Ein zweiter wachstumsassoziierter Endpunkt, der für maligne transformierte Zellen charakteristisch ist, besteht in der Fähigkeit der Zellen anheftungsunabhängig zu proliferieren, und wird im Weichagar-Koloniebildungstest untersucht. Die Kopplung beider In-vitro-Testsysteme sollte eine effektivere und präzisere Bestimmung des kanzerogenen Potenzials von Chemikalien ermöglichen, und die Sensitivität des BALB/c-3T3-Zelltransformationstest erhöhen.

Die untersuchten exogenen Metabolisierungssysteme „S9-Mix“ und die „Zelllinie HepaRG®“, die unter bestimmten Kulturbedingungen die einzigartige Fähigkeit besitzt, fremdstoffmetabolisierende Enzyme dauerhaft und stabil zu exprimieren, wurden unter den Voraussetzungen der vorliegenden Arbeit als nicht ausreichend geeignet beurteilt. Zwar konnte mit dem S9-Mix im Fall der Prokanzerogene Benzo[a]pyren, Aflatoxin B1 (AFB1) und Dimethylnitrosamin im Vergleich zu den Ergebnissen ohne metabolische Aktivierung ein erhöhtes transformierendes Potenzial nachgewiesen werden, jedoch führte auch die Kontrolle, in der die Zellen ausschließlich mit S9-Mix inkubiert wurden, zu einer Focibildung. Des Weiteren führte die Testsubstanz und ihre potenziell gebildeten Metabolite in beiden Modellen, in denen die HepaRG®-Zellen in den BALB/c-3T3-Zelltransformationstest integriert wurden, nicht zu einem im Vergleich zur Kontrolle erhöhten transformierenden Effekt. Mit dem kombinierten Testsystem, das den BALB/c-3T3-Zelltransformationstest und den Weichagar-Koloniebildungstest koppelt und somit die Bestimmung zweier wachstumsassoziierter Endpunkte der Kanzerogenese ermöglicht, wurden die genotoxische Modellsubstanz AFB1 und die nicht-genotoxischen Substanzen Natriumarsenat, Okadasäure und Natriumsaccharin auf ihr kanzerogenes Potenzial hin untersucht. Nach einer Kultivierungsdauer von sieben Tagen im Weichagar weisen die im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest mit den verschiedenen Testsubstanzen behandelten Zellen ein im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle kontinuierlich erhöhtes Zellwachstum auf.

Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit resultiert, dass das kombinierte Testverfahren zur Prüfung genotoxischer Substanzen noch weiterer Entwicklungszeit bedarf, in der insbesondere die metabolische Aktivierung der Testsubstanzen optimiert werden muss. Im Fall nicht-genotoxischer Substanzen kann aufgrund der in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse mit dem kombinierten Testverfahren grundsätzlich die Bestimmung zweier morphologischer, wachstumsassoziierter Endpunkte erfolgen. Doch auch hier sind noch einige Verbesserungen, die besonders den Arbeitsaufwand und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse betreffen, notwendig. Nicht zuletzt, da vergleichbare Systeme zur Prüfung nicht-genotoxischer Substanzen fehlen, besitzen die Zelltransformationstests in diesem Bereich eine besondere Bedeutung. In der Gesamtheit der In-vitro-Testbatterie könnte das kombinierte Verfahren ein hilfreiches Werkzeug sein, das kanzerogene Potenzial von Chemikalien zu ermitteln und einen Beitrag zur Reduzierung der Zahl an Tierversuchen im Rahmen der Kanzerogenitätsprüfung zu leisten.

abstract (englisch)

Within the framework of the actual legal requirements to bring out chemicals the use of alternative methods in carcinogenicity testing of chemical compounds is gaining increasing interest. The BALB/c-3T3 cell transformation assay and the soft agar colony formation assay are two well known in vitro methods to test the carcinogenic potential of chemicals. By means of the BALB/c-3T3 cell transformation assay one can simulate certain stages of the carcinogenesis process and identify alterations in cellular growth due to the exposure to potentially carcinogenic chemicals. The cell growth associated endpoint of this test system is the loss of cell-cell contact inhibition, which results in the formation of so-called foci. Because of their limited metabolic capacity a major drawback of the cell transformation assays is the examination of chemical compounds, which initially require a metabolic transformation to gain their full genotoxic potential. Because of this limitation, in a first step two different exogenous drug metabolizing systems coupled to the BALB/c-3T3 cell transformation assay were tested in this study. The second in vitro method, the soft agar colony formation assay, is used to study another cell growth associated endpoint. The ability to grow in a semisolid medium is also a characteristic feature of malignantly transformed cells. The coupling of these two in vitro test systems in a second step of this study should facilitate a more effective and precise determination of the carcinogenic potential of chemicals and increase the sensitivity of the BALB/c-3T3 cell transformation assay.

The two exogenous drug metabolizing systems, the “S9 mix” and the human cell line HepaRG®, which expresses a multiplicity of drug metabolizing enzymes, could not meet the requirements of this study. However, there was a transforming effect with the metabolically activated compounds benzo[a]pyrene, aflatoxin B1 (AFB1), and dimethylnitrosamine in comparison to the data obtained in the absence of a drug metabolizing system. But there was also a transforming effect due to the exposure of the cells to the S9 mix alone, without any chemical compound added. The combination of the two in vitro test methods, the BALB/c-3T3 cell transformation assay and the soft agar colony formation assay, facilitates the determination of two cell growth associated morphological endpoints in one single test system. The genotoxic model substance AFB1 and the non-genotoxic substances sodium arsenate, okadaic acid, and sodium saccharin, known to be so-called tumour promoters, were tested in the new in vitro test system. After a cultivation time of seven days in the soft agar the cells, which were previously exposed to the test compound in the BALB/c-3T3 cell transformation assay, show an increase in colony formation compared to the solvent control, which reflects the ability of the cells to grow unattached to a surface.

The results of this study show that there is still a need for the further optimization of the combined test system, especially for the testing of genotoxic compounds regarding the exogenous drug metabolizing system. The examination of non-genotoxic compounds by determining two cell growth associated endpoints can, based on the findings of this study, principally be done with the combined system, whereas the test system still needs to be optimized. Particularly, the workload and the reproducibility of the results need to be improved. In the case of tumor promoters this is particularly important, since there are no alternative in vitro test systems to identify these kinds of compounds. The combined test system may provide a useful tool for the prediction of the carcinogenic potential of chemicals in the near future and may help to reduce the amount of animal experiments needed for the carcinogenicity testing of chemicals.

keywords

In-vitro-Testsystem, Kanzerogenitätsprüfung von Chemikalien, Zelltransformationstests, In vitro test system, carcinogenicity testing, cell transformation assaya

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