Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Vanessa Bono Contioso

 

 Investigation upon the phenotypic modulation of histiocytic cells

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108905

title (ger.)

Studien über die phänotypische Modulation histiozytärer Zellen

Title (esp.)

Investigación sobre la modulación fenotípica de células histiocíticas

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bonocontiosov_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Histiozytäre Zellen stellen eine wichtige, heterogene Familie dar, die sowohl bei der angeborenen Immunantwort als auch bei der Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase benötigt werden. Neben diesen physiologischen Funktionen treten jedoch auch proliferative Erkrankungen auf, die von histiozytären Zellen ausgehen, wobei das histiozytäre Sarkom die gefürchtetste Veränderung darstellt. Dieser maligne Tumor besitzt sowohl beim Menschen als auch beim Hund eine schlechte Prognose. Da die Untersuchung pathogenetischer Mechanismen in Gewebeproben oftmals schwierig ist, stellen in vitro Studien eine Möglichkeit dar, diese Limitierungen zu umgehen. Eine Option bildet dabei eine permanente, kanine, histiozytäre Sarkomzelllinie (DH82-Zellen), die ursprünglich von einem Hund mit einem disseminierten, histiozytären Sarkom isoliert wurde. Die schlechte Prognose von Patienten mit einem histiozytären Sarkom resultiert oftmals aus der Ineffektivität bestehender Therapien, so dass alternative Behandlungsansätze dringend benötigt werden. Eine interessante Möglichkeit könnte die onkolytische Virustherapie darstellen. Dabei werden Viren zur Zerstörung der neoplastischen Zellen unter weitgehender Schonung nicht-transformierten Gewebes, verwendet. Das kanine Staupevirus (canine distemper virus, CDV), welches nahe mit dem oft untersuchten Masernvirus verwandt ist, könnte einen interessanten Kandidaten als derartiges onkolytisches Virus darstellen. Abgesehen von einer direkten Elimination der Tumorzellen können onkolytische Viren zu einer Beeinflussung des Tumormikromilieus und / oder der Funktion der transformierten Zellen führen. Die Metastasenbildung ist eine der häufigsten, fatalen Folgen einer Tumorerkrankung. Für diesen Vorgang werden verschiedene Abläufe benötigt. Zu diesen zählen eine Modifikation des Zytoskeletts um eine Zellmigration zu ermöglichen, eine Regulation der Adhäsionsmoleküle und eine Degradation der extrazellulären Matrix, beispielsweise durch Matrix-Metalloproteinasen (MMPs).

Die Ziele der vorliegenden Studie waren (I) die Analyse der Expression verschiedener Zelloberflächenmoleküle in verschiedenen Passagen von DH82-Zellen um mögliche Passageunterschiede zu erkennen, die eventuell entscheidend für die Interpretation und Übertragbarkeit auf in vivo-Mechanismen sind und (II) die Bestimmung der Cortactin-Expression und Verteilung in nicht-infizierten und persistierend CDV-infizierten DH82-Zellen, wobei es sich bei Cortactin um ein wichtiges, für die Zellmigration benötigtes Protein handelt.

Des Weiteren sollte (III) die Expression von Matrix-Metalloproteinasen und ihrer Inhibitoren in kaniner Mikroglia bei verschiedenen, intrakraniellen Erkrankungen untersucht werden.

Ähnlich wie bei Studien anderer Zelltypen zeigten DH82-Zellen eine verschiedene Morphologie in frühen und späten Passagen. Wichtiger ist jedoch, dass es bei späten Passagen zu einer Herabregulierung typischer, histiozytärer Oberflächenmarker wie CD11c, CD14, CD18, CD45 und CD80 kam. Diese können entscheidend bei der Interpretation der Befunde sein, die durch Untersuchung verschiedener Passagen zustande kamen.

Neben der Expression von Zelloberflächenmolekülen besitzen viele histiozytäre Zellen die Fähigkeit zur Migration durch Reorganisation des Zytoskeletts. Bemerkenswerterweise ist die Migrationsfähigkeit bei persistierend CDV-infizierten DH82-Zellen verglichen mit nicht-infizierten Zellen herabgesetzt, was für eine Reduktion des Metastasierungspotentials sprechen könnte. Die Cortactin-Analyse ergab einen gleichen Prozentsatz exprimierender Zellen, unabhängig davon, ob sie eine CDV-Infektion aufwiesen oder nicht. Nichtsdestotrotz zeigte sich 1 und 3 Tage nach Aussaat eine randständige Expression bei nicht-infizierten Zellen, wohingegen persistierend CDV-infizierte Zellen eine diffuse, zytoplasmatische Verteilung aufwiesen. Letztere ist als „inaktive“ Form beschrieben, die für die verminderte Migration verantwortlich sein könnte.

Mikroglia sind ortsständige, histiozytäre Zellen des zentralen Nervensystems, die ihre Umgebung durch die Produktion von MMPs und ihren Inhibitoren modifizieren können. Bei verschiedenen, intrakraniellen Erkrankungen war die Expression von MMPs und ihren Inhibitoren aufreguliert, wobei dies weitgehend unabhängig von der zugrundeliegenden Erkrankung erfolgte, so dass kein krankheitsspezifisches Expressionsmuster festgestellt werden konnte.

Zusammengefasst handelt es sich bei histiozytären Zellen um Zellen, die durch ihre Migrationsfähigkeit und ihre Modifikation des umgebenden Mikromilieus eine wichtige Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, von intrakraniellen Läsionen bis zu malignen, histiozytären Neoplasien, spielen. Dabei sollte bei in vitro-Studien die Passagezahl bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden.

abstract (englisch)

Histiocytic cells represent an important, heterogeneous cell family, involved in innate immune response and maintaining of tissue homeostasis. However, beside these physiological functions, proliferative disorders originating from histiocytic cells could occur, the most devastating one being the disseminated histiocytic sarcoma. This malignant tumor exhibits a poor prognosis in both, humans and dogs. Since the analysis of pathogenetic mechanisms remains difficult in tissue sections, in vitro studies are one way to overcome these limitations. One possibility represents the permanent canine histiocytic sarcoma cell line (DH82 cells) originally isolated from a dog with disseminated histiocytic sarcoma. The poor prognosis of individuals suffering from histiocytic sarcoma is often the result of ineffective therapies highlighting the need for alternative treatment strategies. An interesting approach might be the oncolytic virotherapy, in which viruses are used to destroy tumor cells while largely sparing non-transformed tissues. Canine distemper virus (CDV), a morbillivirus closely related to the often studied measles virus, might be a promising candidate of such an oncolytic virus. Besides direct elimination of neoplastic cells, oncolytic viruses can modify the tumor microenvironment and / or the function of transformed cells. Metastasis is one of the most common, fatal consequences of tumors. For this process different steps are required including modification of the cytoskeleton to allow cell migration, regulation of adhesion molecules and degradation of the extracellular matrix for example by matrix metalloproteinases.   

The aims of the present study were (i) to analyze the expression of cell surface molecules in different passages of DH82 cells to identify possible inter-passage variances which might be crucial to interpretation and transferability of the results to in vivo mechanisms and (ii) to determine the expression and distribution of cortactin, an important molecule needed for cell migration, in DH82 cells with or without persistent canine distemper virus infection.

Furthermore, the third aim of the study was to investigate the expression of matrix-metalloproteinases and their inhibitors in canine microglia, specialized central nervous system histiocytic cells, in different intracranial diseases.

Comparable to studies in other cell types, DH82 cells revealed a different morphology at early and late passages, and, more intriguingly, a down-regulation of typical histiocytic surface markers such as CD11c, CD14, CD18, CD45 and CD80. The latter might be crucial for result interpretation obtained by using different passages in experimental setups.

Beside the expression of cell surface molecules, many histiocytic cells, including DH82 cells, are able to migrate by rearrangement of the cytoskeleton. Remarkably, DH82 cells persistently infected with CDV displayed a reduced migratory capacity compared to non-infected controls, which might account for a reduction in the metastatic potential. Evaluation of cortactin revealed the same percentage of cells expressing this protein independent of the infection status. However, non-infected DH82 cells possessed a membrane-accentuated distribution at 1 and 3 days post seeding whereas persistently CDV-infected cells showed a diffuse cytoplasmic expression. The latter is described as being the “inactive” state, which might account for the reduced migration.

Microglia, resident central nervous system histiocytic cells, are able to modify their microenvironment by producing MMPs and their inhibitors. In different intracranial diseases the expression of MMPs and their inhibitors is up-regulated.  However, this reaction seems to be widely independent of the underlying cause with the result that no disease-specific expression pattern could be recognized.

In conclusion, histiocytic cells and their migration ability as well as their modification of the surrounding microenvironment, play an important role in different diseases ranging from intracranial disorders to malignant histiocytic neoplasms. However, in in vitro studies, the passage number used, has to be taken into account in interpretation of the results.

Abstract (spanisch)

Las células histiocíticas representan una importante y heterogénea familia celular involucrada en la respuesta inmunitaria innata y en el mantenimiento de la homeostasis tisular. Sin embargo, aparte de estas funciones fisiológicas, pueden presentarse enfermedades proliferativas con origen en células histiocíticas, siendo el sarcoma histiocítico diseminado la más devastadora de éstas. Este tumor maligno presenta un mal pronóstico tanto en humanos como en perros. Dado que el análisis de los mecanismos patogenéticos en secciones de tejido sigue presentando dificultad, los estudios in vitro se consideran un modo de superar estas limitaciones. Una expectativa la constituye la línea celular permanente de sarcoma histiocítico canino (células DH82),que fue aislada originalmente de un perro afectado de sarcoma histiocítico diseminado.  El infausto pronóstico de los individuos que sufren de sarcoma histiocítico es, frecuentemente, el resultado de terapias inefectivas, subrayando la necesidad de estrategias de tratamiento alternativas. La viroterapia oncolítica, en la cual se usan virus para destruir células tumorales sin afectar en gran medida a tejidos no transformados, ofrece un enfoque interesante en este sentido. El virus del moquillo canino (CDV), un morbillivirus estrechamente relacionado con el frecuentemente estudiado virus del sarampión, podría ser un candidato prometedor como virus oncolítico. Además de la eliminación directa de células neoplásicas, los virus oncolíticos pueden modificar el microentorno tumoral y / o la función de las células transformadas. La metástasis es una de las consequencias fatales más comunes de los tumores. Para este proceso se requieren diversos pasos incluyendo la modificación del citoesqueleto para permitir la migración celular, la regulación de moléculas de adhesión y la degradación de la matriz extracelular, por ejemplo, por las metaloproteasas de la matriz (MMPs).   

Los objetivos del presente estudio fueron (i) analizar la expresión de moléculas de la superficie celular en pases diferentes de células DH82, para identificar posibles variaciones intrínsecas del subcultivo que podrían ser cruciales para la interpretación y transferibilidad de los resultados a mecanismos in vivo y (ii) determinar la expresión y distribución de cortactin, una molécula importante y necesaria para la migración celular, en células DH82 con o sin infección persistente con el virus del moquillo canino. 

Asimismo, la tercera finalidad de este estudio se concentró en investigar la expresión de metaloproteinasas de la matriz y de sus inhibidores en la microglía canina, células histiocíticas especializadas del sistema nervioso central, en diversas enfermedades intracraneales.

Las células DH82, equiparable a estudios basados en otros tipos de células, mostraron una morfología distinta en subcultivos de células de pases tempranos y tardíos  y, curiosamente, evidenciaron una regulación negativa de marcadores histiocíticos típicos de superficie tales como CD11c, CD14, CD18, CD45 y CD80. Estos últimos podrían ser de crucial importancia para la interpretación de los resultados obtenidos al usar diferentes pases de células en los ensayos experimentales.

Además de la expresión de moléculas de la superficie celular, muchas células histiocíticas, y entre ellas las células DH82, son capaces de migrar reorganizando su citoesqueleto. Sorprendentemente, las células DH82 con infección persistente de CDV exhibieron una capacidad migratoria reducida en comparación con controles no infectados, lo que podría justificar la disminución de su potencial metastático. La evaluación de cortactin reveló un idéntico porcentaje de células expresando esta proteína, independientemente de su estado de infección. Sin embargo, células DH82 no infectadas mostraron una distribución de la expresión acentuada en la membrana en los dias 1 y 3 tras su cultivo, mientras que la expresión de cortactin en las células con infección persistente de CDV aconteció de manera difusa con localización citoplasmática. Lo último ha sido descrito como el estado “inactivo”, lo que podría explicar la reducción migratoria.

La microglía, células histiocíticas residentes del sistema nervioso central, son capaces de modificar su microentorno mediante la producción de MMPs y sus inhibidores. La expresión de MMPs y sus inhibidores se ve incrementada en diversas enfermedades intracraneales. No obstante, esta reacción parece ocurrir independientemente de la causa subyacente y, por consiguiente, no se pudo reconocer ningún patrón de expresión específico de la enfermedad. 

En definitiva, las células histiocíticas y su capacidad migratoria, así como su habilidad para modificar el medio que las rodea, juegan un papel importante en diversas enfermedades, abarcándo desde desórdenes intracraneales hasta neoplasias histiocíticas malignas. No obstante, el número de pases de cultivo celular en estudios in vitro tiene que ser tomado en consideración a la hora de interpretar los resultados.

keywords

Canine histocyticsarcoma cells (DH82), Canine Distemper Virus (CDV), Viral oncolysis, Kanine histozytäre Sakromzellinie, kanine Staupevirus, onkolytische Virustherapie

kb

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