Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Sarah-Maria Bölicke

Die Oxidation der Methoxyphenole Syringol, Guajakol, 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol in Pökellaken und in erhitzter Fleischmatrix

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107126

title (engl.)

The oxidation of the methoxyphenols syringol, guaiacol, 4-methylsyringol and 4-methylguaiacol in curing brine and in heated meat matrix

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/boelickes_ws15.pdf

abstract (deutsch)

Die Räucherung von Lebensmitteln gehört zu den ältesten Konservierungsverfahren, welches auch in der heutigen Lebensmittelherstellung eine breite Anwendung findet. Dies ist neben den antioxidativen auch den geschmacksgebenden Eigenschaften der Rauchinhaltsstoffe zuzuschreiben, wobei bezüglich dieser Eigenschaften besonders die phenolischen Verbindungen hervorzuheben sind, welche vor allem durch den pyrolytischen Abbau des Holzbestandteils Lignin entstehen. Innerhalb dieser Phenolfraktion spielen die Methoxyphenole Syringol und Guajakol sowie ihre alkylsubstituierten Derivate aufgrund ihrer starken aromatisierenden und antioxidativen Wirkung und ihrer hohen Konzentrationen im Rauch aber auch in den geräucherten Fleischprodukten eine bedeutende Rolle. Obwohl die Konzentrationen dieser vier Methoxyphenole in Lebensmitteln, Räucherrauch und Raucharomen in Abhängigkeit von verschiedenen Räucherverfahren, Holzarten, Räucherprodukten und anderen lebensmitteltechnologischen Faktoren bereits intensiv untersucht worden sind, liegen bezüglich ihrer Oxidation in Fleischprodukten bisher wenige und teilweise widersprüchliche Daten vor. Der Abbau der Phenole und die Bildung von Oxidationsprodukten sind von besonderer Bedeutung, wenn den Lebensmitteln neben dem Räucherrauch auch Nitritpökelsalz zugesetzt wird, wie es beim Pökeln der Fall ist. Neben den lebensmitteltechnologisch als positiv zu bewertenden Eigenschaften der Pökelung, wie der Konservierung, der Aromatisierung und der Umrötung des gepökelten Fleisches wurden im Zusammenhang mit diesem Konservierungsverfahren auch negative Effekte, wie die Bildung von kanzerogenen Nitrosaminen nachgewiesen. Da das Räuchern und die Pökelung von Fleischerzeugnissen oft als miteinander kombinierte Herstellungsverfahren für Fleischerzeugnisse auftreten, besteht folglich die Möglichkeit der Nitrierung bzw. Nitrosierung der durch den Rauch in das Fleisch eingebrachten phenolischen Verbindungen. Für verschiedene Nitrosophenole ist bereits ein fördernder Effekt auf die Nitrosaminbildung nachgewiesen worden und auch die Nitrosophenole selbst weisen teilweise genotoxische Wirkungen auf. Daher ist die Aufklärung des Abbaus der vier Methoxyphenole Guajakol, Syringol, 4-Methylguajakol und 4-Methylsyringol in geräucherten und gepökelten Fleischerzeugnissen hinsichtlich der damit gegebenenfalls verbundenen Bildung solcher nitrosierten bzw. nitrierten Oxidationsprodukte von besonderem Interesse. Ziel dieser Studie war es daher, die Oxidation dieser vier Verbindungen in selbst hergestellten Fleischproben zu untersuchen, sowie gebildete Oxidationsprodukte zu isolieren und zu identifizieren. Des Weiteren wurden Pökellaken hergestellt, mit Hilfe derer die Oxidation im wässrigen Modell unter ähnlichen Bedingungen, wie den in den Fleischproben hergestellten, untersucht werden sollte. Hierfür wurden zunächst geeignete HPLC-UV/VIS, GC-MS sowie HPLC-MS Methoden entwickelt, um die chromatographische Trennung sowie die sichere Identifikation der Phenole und der aus den Pökellaken und Fleischproben isolierten Substanzen zu gewährleisten. Die Entwicklung einer schonenden Extraktionsmethode für die Oxidationsprodukte der Phenole aus der Fleischmatrix wurde durchgeführt, da die in vorherigen Studien verwendeten Methoden bisher keine sichere und erfolgreiche Extraktion eventuell gebildeter Nitrosophenole ermöglichten. Sowohl aus den Pökellaken als auch aus den Fleischproben gelang die Extraktion der Oxidationsprodukte von Syringol und Guajakol, welche mittels GC-MS und LC-ESI-MS als 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol, 6-Nitroguajakol, Nitrososyringol, Nitrosyringol und 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol identifiziert werden konnten. Mit Ausnahme von 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol wurde die Bildung der genannten Oxidationsprodukte im Rahmen dieser Studie erstmalig in der Fleischmatrix nachgewiesen. Die Untersuchung ihrer Entstehung in Abhängigkeit vom pH-Wert und der Ascorbinsäurekonzentration in Pökellaken bzw. von der Nitrit-und Sauerstoffkonzentration in Fleischproben wurde auf diese Weise das erste Mal durchgeführt. Auch im Falle von 4-Methylsyringol und 4-Methylguajakol wurden verschiedene Oxidationsprodukte aus beiden Probenmatrices isoliert, deren Identität jedoch nicht aufgeklärt werden konnte. Die Pökellaken, die unter Zugabe der Phenole, 1,66 % Nitritpökelsalz (150 mg/kg NaNO2) und unterschiedlichen Konzentrationen des Antioxidationsmittels Ascorbinsäure hergestellt wurden, wurden zunächst für 40 min auf 80 °C erhitzt und anschließend für 1 h bei pH 3 und 40 °C erwärmt. Erstes Verfahren sollte der Simulation des Erhitzens während der Herstellung des Räucherproduktes z. B. durch das Heißräuchern bzw. Braten dienen, während das Absenken des pH-Wertes sowie das Erwärmen der Laken die Bedingungen, wie sie während der Verdauung im Magen herrschen, nachstellen sollten. Es zeigte sich, dass Ascorbinsäure bei einer Konzentration von 500 mg/L in der Pökellake im Vergleich zu einem Ascorbinsäurezusatz von 100 mg/L nach dem Erhitzen auf 80 °C zu einem verstärkten Abbau von Syringol aber nicht von Guajakol führte. Eine Erniedrigung des pH-Werts auf 3 förderte den Abbau des jeweiligen Phenols, wobei dies (mit Ausnahme der Proben, die Syringol und 100 mg/L Ascorbinsäure enthielten) bezogen auf 6-Nitrosoguajakol, 4-Nitroguajakol, 6-Nitroguajakol und Nitrososyringol stets mit einer vermehrten Bildung der jeweiligen Oxidationsprodukte verbunden war. Auch die Fleischproben, die neben den Phenolen ebenfalls Ascorbinsäure als Antioxidationsmittel enthielten, wurden auf 80 °C erhitzt und anschließend der simulierten Verdauung durch Zugabe von Salzsäure und Pepsin sowie dem Erwärmen auf 40 °C für 1 h unterzogen. Hierbei sollte der Effekt unterschiedlicher Nitritkonzentrationen in den Fleischproben auf die Oxidation der Phenole bestimmt werden. Weiterhin wurden Fleischschäume, die mit Luft oder unter Sauerstoffatmosphäre aufgeschlagenen Eischnee enthielten, auf die Entstehung der Oxidationsprodukte hin untersucht. Während sich 6-Nitrosoguajakol zusammen mit 4-Nitroguajakol und 6-Nitroguajakol nur unter den Bedingungen der simulierten Verdauung bei stark erhöhten Nitritkonzentrationen von 400 mg/kg in den Fleischproben bildeten, war 6-Nitrosoguajakol als einziges Oxidationsprodukt des Guajakols auch in den mit Luft und Sauerstoff aufgeschäumten Fleischproben, welchen lediglich 150 mg/kg NaNO2 zugesetzt wurde, nach deren simulierter Verdauung nachweisbar. Das Produkt 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol bildete sich in allen Fleischproben, wobei unter den Bedingungen der simulierten Verdauung stets mehr dieses Syringoldimers entstand, als nach dem alleinigen Erhitzen auf 80 °C. Je höher hierbei die Nitritkonzentration war, desto mehr dieser Verbindung wurde gebildet, wobei sich dessen Konzentration bei 400 mg/kg NaNO2 in der Fleischprobe im Vergleich zu den Proben mit 150 mg/kg um das 4-fache erhöhte. Für die Produkte Nitrososyringol und Nitrosyringol, welche nur nach der simulierten Verdauung der Fleischproben vorlagen, zeigte sich ebenfalls eine Vervielfachung der Konzentration in den Proben mit 400 mg/kg NaNO2 im Vergleich zu den Proben mit 150 mg/kg NaNO2 bzw. der Hälfte dieser Konzentration (75 mg/kg NaNO2). Die Applikation der gesetzlich nach Zusatzstoffzulassungsverordnung erlaubten Höchstmenge von 150 mg/kg NaNO2 im Fleischerzeugnis (oder der Hälfte dieser Konzentration) ohne gleichzeitige Zugabe von Eischnee führte folglich nur beim Syringol zur Bildung von Oxidationsprodukten. In Fleischschäumen, wie sie z. B. in der traditionellen französischen Küche hergestellt werden (Fleischmousses und –parfaits), ist jedoch auch bei einer Nitritkonzentration von 150 mg/kg während der Verdauung die Nitrosierung von Guajakol möglich. Da besonders im Falle von Syringol und seinem im Fleisch bevorzugt gebildetem Reaktionsprodukt 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol bereits deren antioxidative und für Syringol auch antinitrosierende Wirkungen nachgewiesen wurden, ist gerade beim Einsatz dieses v.a. beim Räuchern mit Hartholz gebildetem Methoxyphenols von einem lebensmitteltechnologisch positiven Effekt auszugehen. Da bezüglich der Wirkung der Oxidationsprodukte von Guajakol wenige Daten vorliegen, sind vor der Bewertung dieses Methoxyphenols weitere Untersuchungen erforderlich. Die Bildung der in dieser Studie nachgewiesenen Oxidationsprodukte ist bei der Entwicklung lebensmitteltechnologischer Verfahren, besonders bei dem Einbringen von sauerstoffhaltigen Schäumen, wie sie bei der Herstellung von Fleischmousses und –parfaits verwendet werden, zu berücksichtigen. Dies sollte besonders im Hinblick darauf geschehen, dass selbst wenn im geräucherten und gepökelten Fleischprodukt kein Nachweis der jeweiligen Reaktionsprodukte erfolgt, sogar bei der Verwendung gesetzlicher vorgegebener Nitrithöchstmengen eine Bildung selbiger im Magenmilieu nach Auswertung der Ergebnisse dieser Studie als wahrscheinlich zu betrachten ist.

abstract (englisch)

The smoking of food products is one of the oldest preservation methods, which is used also for modern food processing. This is caused mainly by the antioxidant and flavoring properties of the smoke constituents such as phenolic compounds formed by the pyrolysis of lignin. Because of their high concentration in smoke and in smoked food products the most important components of the phenolic fraction are the methoxyphenols syringol, guaiacol and their alkylated derivatives. Although the contents of this methoxyphenols in smoked foods, smoke and smoke flavorings were studied in dependence of smoking conditions, kind of wood and kind of food products little information are available about the oxidation of these compounds in the meat matrix. The oxidation and degradation of these phenols are of particular interest, if smoking is applied to cured meat products, because the nitration or nitrosation of smoke derived phenols is possible. For many nitrosophenols an enhancing effect to nitrosamine formation had been determined and even the nitrosophenols themselves can develop genotoxicity. Therefore the investigation of oxidative degradation of the four methoxyphenols guaiacol, syringol, 4-mehylguaiacol and 4-methylsyringol is of specific interest regarding the formation of nitrated or nitrosated reaction products in cured and smoked meat. Because of these considerations the aim of the present study was to analyze the oxidation of these methoxyphenols by extraction and identification of their associated oxidation products formed in curing brine and meat matrix. Therefore HPLC-UV/VIS, GC-MS and LC-MS methods were developed to enable the chromatographic separation and identification of the extracted compounds. In addition a extraction method had to be used, because extraction methods of earlier studies seemed to be not applicable for the isolation of formed nitrosophenols from meat matrix. In this study the extraction of the oxidation products of guaiacol and syringol was performed, which were identified by GC-MS and LC-ESI-MS as 6-nitrosoguaiacol, 4-nitroguaiacol, 6-nitroguaiacol, nitrososyringol, nitrosyringol and 3,3′,5,5′-tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol. With exception of 4-nitroguaiacol and 6-nitroguaiacol the formation of these reaction products was determined for the first time in meat matrix. In addition the investigation of their formation under different oxidation conditions such as different concentrations of ascorbic acid and pH-values in the curing brines as well as different amounts of sodium nitrite or oxygen contents in the meat matrix had not been performed yet. Although oxidation products of 4-methylsyringol and 4-methylguaiacol were extracted from curing brine and meat samples, it was not possible to identify these isolated compounds in this study. The brines were prepared by addition of the phenols, 1,66 % curing salt (containing 0,9 % NaNO2), and different concentrations of ascorbic acid. The brines were heated to 80 °C for 40 min and afterwards the pH was adjusted to 3 with hydrochloric acid and the samples were heated to 40 °C for 1 hour. The first procedure was applied in order to simulate heating during food processing such as hot smoking or frying while the second experiment was made to simulate reaction conditions during gastric digestion. It was shown that a concentration of 500 mg/L ascorbic acid in the brine led to a higher degradation of syringol if the samples were heated to 80 °C compared to the brines which contained 100 mg/L ascorbic acid. For guaiacol no differences appeared comparing these two batches. Lowering the pH to 3 following simulated digestion enhanced the degradation of both methoxyphenols and formation of the oxidation products 6-nitrosoguaiacol, 4-nitroguaiacol, 6-nitroguaiacol and nitrososyringol (with exception of the brines, which contained syringol and 100 mg/L ascorbic acid). The meat samples, which contained the phenols, ascorbic acid at a constant concentration of 100 mg/kg and different contents of NaNO2 were heated to 80 °C. Afterwards simulated digestion was applied to the samples by addition of hydrochloric acid and pepsin and by heating at 40 °C for 1 hour. In addition meat mousses were prepared containing 150 mg/kg NaNO2, ascorbic acid and foamed egg whites, which were foamed with air or under oxygen atmosphere in order to determine the effect of different oxygen contents on phenol oxidation in meat matrix. Whereas 6-nitrosoguaiacol, 4-nitroguaiacol and 6-nitroguaiacol were successfully isolated from the batches containing 400 mg/kg sodium nitrite after simulated digestion, in the meat mousses only 6-nitrosoguaiacol was formed during simulated digestion. Formation of the dimer 3,3′,5,5′-tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol was determined in all meat samples, while nitroso- and nitrosyringol were isolated only after the digestion experiments. Furthermore application of simulated digestion after heating at 80 °C enhanced the generation of the syringol dimer. After simulated digestion the concentration of 3,3′,5,5′-tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol in the samples which contained 400 mg/kg NaNO2 raised to the fourfold compared to the samples which contained only 150 mg/kg NaNO2 and also the concentration of nitrososyringol and nitrosyringol was highest in the samples with 400 mg/kg NaNO2 as well. In conclusion application of the legally allowed level of nitrite (150 mg/kg in meat products following the german food additive law) without further addition of foam led to product formation only in case of syringol, while formation of 6-nitrosoguaiacol was determined in the meat mousses after simulated digestion even at 150 mg/kg NaNO2 . For syringol and its main reaction product in meat matrix, the dimer 3,3′,5,5′-Tetramethoxy-1,1′-biphenyl-4,4′-diol, antioxidative properties had been determined. Since syringol is one of the most important flavoring components of smoke, its specific application in smoke-derived products during meat processing could be one possible implementation to exploit the beneficial properties of this compound and its predominant oxidation product. Further investigations on the oxidation of guaiacol in cured and smoked meat are required, since the formation of its oxidation products was also shown in meat mousses at moderate sodium nitrite levels after simulated digestion in this study. In summary oxidation of the smoke phenols and formation of the associated reaction products should be considered an important aspect of food processing especially for the production of oxygen containing meat mousses and parfaits.

keywords

methoxyphenols, oxidation, meat matrix/ Methoxyphenole, Oxidation, Fleischmatrix

kb

2.103