Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 

 Stefanie Blodkamp

 

 The effect of antimicrobial peptides on the innate host responses against zoonotic Staphylococcus aureus

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107867

title (ger.)

Der Effekt von antimikrobiellen Peptiden auf die angeborene Wirtsantwort gegen zoonotische Staphylococcus aureus

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/blodkamps_ss16.pdf

abstract (deutsch)

Staphylococcus aureus ist ein wichtiger zoonotischer Krankheitserreger, welcher bei Menschen und Tieren eine Vielzahl von Erkrankungen verursachen kann. Durch die zunehmende Resistenz von S. aureus gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen wird die Bekämpfung von Infektionen, an denen dieser Erreger ursächlich beteiligt ist, erheblich erschwert. Ein besonderes Problem stellen dabei Methicillin-resistente S. aureus (MRSA)-Isolate, inklusive der von Nutztieren stammenden sogenannten „livestock-associated MRSA (LA-MRSA)“, dar, die häufig auch Resistenzen gegenüber mehreren anderen Wirkstoffklassen aufweisen. Künftig werden dringend Behandlungsalternativen zur Antibiose benötigt, wie zum Bespiel die Stärkung des Immunsystems. Da bereits frühere Studien gezeigt haben, wie wichtig antimikrobielle Peptide (AMPs) und hierbei besonders Cathelicidine für die Immunantwort gegenüber S. aureus-Infektionen sind, stellen AMPs vielversprechende Kandidaten für die Behandlung von Staphylokokkeninfektionen dar. Daher war das Ziel dieser These, Mechanismen zu untersuchen, welche einen möglichen Einfluss auf die Interaktion von Cathelicidinen mit S. aureus, insbesondere LA-MRSA, haben.

Zu diesem Zweck wurden 153 LA-MRSA-Isolate hinsichtlich ihrer minimalen Hemmkonzentrationen (MHKs) für fünf Cathelicidine, welche von der Maus, dem Menschen, dem Kaninchen und dem Rind stammen, untersucht (Kapitel 4). Unabhängig von ihrer Herkunft zeigten alle Isolate Cathelicidin-spezifisch annähernd gleiche MHK-Werte. Für die vom Menschen und Maus stammenden AMPs, LL-37 und mCRAMP, wurden die höchsten MHKs mit ≥128 mg/L ermittelt, während alle Isolate vergleichsweise geringe MHK Werte für die beiden bovinen Cathelicidine zeigten (4-16 mg/L beziehungsweise 2-16 mg/L). Des Weiteren wurde der Einfluss von bekannten Antibiotika- und Schwermetall-Resistenzgenen auf die AMP-MHK Werte analysiert. Die Präsenz von Resistenzgenen veränderte die AMP-MHKs nicht, woraus sich schlussfolgern lässt, dass die getesteten antimikrobiellen Resistenzgene oder Schwermetall-Resistenzgene keine Resistenz gegenüber den getesteten AMPs vermitteln.

Ferner wurden AMP-MHKs in An- und Abwesenheit unterschiedlicher Efflux Pumpen-Inhibitoren ermittelt (Kapitel 5). In der Anwesenheit eines Inhibitors, 1-(1-Naphthylmethyl)-Piperazine (NMP), der RND Efflux Pumpen inhibiert, sanken die MHKs für CAP18, ein Cathelicidin vom Kaninchen, signifikant. Des Weiteren zeigten S. aureus-Mutanten, denen die RND Efflux Pumpe SecDF gänzlich fehlt oder funktionell deletiert wurde, ebenfalls im Vergleich zu ihrem SecDF-positiven Ausgangsstamm und einer SecDF-komplementierten Mutante signifikant niedrigere MHKs für CAP18 und für BMAP-27. Für die restlichen Cathelicidine konnte dieser Phänotyp nicht beobachtet werden.

Da Cathelicidine eine Schlüsselrolle in der Abwehr von bakteriellen Infektionen durch Neutrophile spielen, wurde im letzten Teil der These untersucht, ob die Efflux Pumpe SecDF zusätzlich zur Veränderung der in vitro AMP-MHKs auch einen Einfluss auf die antimikrobiellen Aktivitäten von Neutrophilen hat (Kapitel 6). Hierfür wurde humanes und bovines Blut, sowie bovine Neutrophile mit einem SecDF-tragenden Wildtyp (WT) Stamm, einem SecDF-defizienten Stamm und einem SecDF-komplementierten Stamm infiziert und das Überleben der Bakterien ermittelt. Der Stamm ohne SecDF zeigte eine höhere Überlebensfähigkeit in Anwesenheit von humanem Blut und bovinen Neutrophilen. Die Ursachen, die dieser Beobachtung zugrunde liegen, müssen jedoch in weiteren Studien geklärt werden. Diese Daten deuten darauf hin, dass SecDF das Überleben von S. aureus in humanem Blut und in Gegenwart von bovinen Neutrophilen beeinflusst.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse spezies-spezifische Unterschiede in der Interaktion von Cathelicidinen mit S. aureus, besonders im Hinblick auf die Aktivität der bakteriellen Efflux Pumpe SecDF. Da ferner die getesteten Resistenzgene keinen Einfluss auf die Wirkung der getesteten AMPs haben, könnte der Einsatz von AMPs bei multi-resistenten S. aureus-Isolaten eine vielversprechende Behandlungsalternative darstellen.

 

abstract (englisch)

Staphylococcus aureus is an important zoonotic pathogen, which can cause various diseases in humans and animals. The treatment of S. aureus infections is dramatically complicated by the organism’s increasing resistance against antimicrobial agents. Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) isolates, including the livestock-associated MRSA (LA-MRSA), represent a particular problem, since they are often resistant to multiple classes of antimicrobial agents. Therefore, alternatives to antibiosis, like the boosting of the immune system, are urgently needed. Since former studies already demonstrated the importance of antimicrobial peptides (AMPs), especially cathelicidins, in the immune response against S. aureus infections, AMPs might be promising candidates for the treatment of staphylococcal infections. Hence, the aim of this thesis was to investigate mechanisms, which might have an influence on the interaction of cathelicidins with S. aureus, particularly LA-MRSA.

For this purpose, the minimal inhibitory concentrations (MICs) of five cathelicidins of human, mouse, rabbit or cattle origin were determined for a collection of 153 LA-MRSA isolates (Chapter 4). All isolates, regardless of their origin, showed similar cathelicidin-specific MICs. The highest MICs with ≥128 mg/L were determined for the human- and mouse-derived AMPs, LL-37 and mCRAMP, respectively, whereas all isolates showed comparatively low MIC values for the two bovine cathelicidins BMAP27 and BMAP28 (4-16 mg/L and 2-16 mg/L). Furthermore, the influence of known antibiotic and heavy metal-resistance genes on the MICs of the AMPs was analyzed. The presence of resistance genes did not alter the MICs, indicating that the tested antibiotic or heavy metal-resistance genes do not confer resistance against the tested AMPs.

Furthermore, MICs of the different AMPs were determined in the presence and absence of different efflux pump inhibitors (Chapter 5). In the presence of one inhibitor, 1-(1-naphthylmethyl)-piperazine (NMP), which inhibits RND efflux pumps, the MICs for CAP18, a rabbit cathelicidin, decreased significantly. Moreover, S. aureus mutants, whose RND efflux pump SecDF was functionally deleted or lacking, showed in comparison to their initial SecDF-positive strain and a complemented mutant also significantly lower MICs for CAP18 and the bovine BMAP-27. For the remaining cathelicidins this phenotype was not seen.

Since cathelicidins play a key role in the defense of neutrophils against bacterial infections, the last part of the thesis dealt with the question, whether the efflux pump SecDF, in addition to the alteration of the in vitro determined MICs, has also an impact on the susceptibility of S. aureus to the antimicrobial functions of neutrophils (Chapter 6). Thus, human and bovine whole blood as well as bovine neutrophils were incubated with a SecDF-positive wildtype (WT) strain, a SecDF-deficient mutant strain as well as a SecDF-complemented strain and their survival was measured. The strain without SecDF showed a better survival in the presence of human blood and bovine neutrophils. The reasons for this observation remain to be investigated. These data indicate that SecDF is able to influence the survival of S. aureus in human blood and in the presence of bovine neutrophils.

Taken together, these results show species-specific differences in the interaction of cathelicidins with S. aureus, particularly with a focus on the activity of the bacterial efflux pump SecDF. Since the tested resistance genes have no impact on the MICs for the different AMPs, the use of AMPs against multi-resistant S. aureus isolates might be a promising alternative to antibiotics.

 

keywords

Antimikrobielle Peptide, Methicillin-resistente Staphylococcus aureus, minimale Hemmkonzentration (MHK), antimicrobial peptides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, minimal inhibitory concentration (MIC)

kb

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