Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Silvia Bienas

Reaktive Sauerstoffspezies-­Produktion durch Mikrogliaaktivierung in der Epileptogenese bei der Ratte

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107108

title (engl.)

Production of reactive oxygen species after microglial activation in the epileptogenesis of rats

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bienass_ws15.pdf

abstract (deutsch)

In der Pathophysiologie der Epileptogenese scheinen Mikrogliazellen eine Schlüsselrolle zu übernehmen. Der genaue Mechanismus, wie sie die Entwicklung eines epileptogenen Netzwerkes beeinflussen, ist immer noch nicht vollständig geklärt.

Mikrogliazellen, die durch pathologische Veränderungen aktiviert werden, verändern teilweise ihre äußere Gestalt, proliferieren und migrieren zu den geschädigten Gehirnregionen. Dort werden von ihnen verschiedenen Mediatoren wie etwa reaktive Sauerstoffspezies (ROS) freigesetzt (Streit et al., 1988, Banati et al., 1993, Ruuls et al., 1995, Kreutzberg, 1996, Sierra et al., 2014).

Das Ziel dieser Studie war, den Zeitverlauf der funktionellen Mikrogliaveränderungen während der Epileptogenese in einem Post-Status epilepticus (SE) Modell bei Ratten zu charakterisieren, wobei der Fokus auf der Produktion von ROS lag.

Ein selbsterhaltender SE wurde durch elektrische Stimulation der rechten basolateralen Amygdala bei weiblichen Sprague-Dawley Ratten induziert. 45 Ratten wurden stimuliert, bei weiteren 45 erfolgten SHAM-Operationen. Diese zweite Tiergruppe diente als Kontrolle. Alle stimulierten Tiere entwickelten während des Beobachtungszeitraumes chronische epileptische Anfälle. 2 Tage, 10 Tage und 12 Wochen nach ausgelöstem SE wurden die Tiere euthanasiert und Mikrogliazellen mittels Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Die Identifizierung der Mikrogliazellen erfolgte in der Durchflusszytometrie aufgrund ihrer Größe und Komplexität in Zusammenhang mit der Expression der Oberflächenmoleküle CD11b/c+, CD18+ und CD45low. Eine funktionelle Charakterisierung fand durch Messung der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies statt: Das nicht fluoreszierende Dihydrorhodamin 123 (DHR; s. 3.1.2) wurde in die Zellen aufgenommen und durch Peroxidase zum grünfluoreszierenden Rhodamin 123 gespalten und im Durchflusszytometer gemessen. Im Nativzustand und nach Stimulation der ROS-Produktion mit PMA (Phorbol-Myristat-Acetat) diente die Peroxidaseaktivität als Maß für die gebildete ROS-Menge.

Die stärksten funktionellen Mikrogliaveränderungen traten zum frühen Messzeitpunkt, 2 Tage nach ausgelöstem Status epilepticus, auf. Nur zu diesem Messzeitpunkt konnte bei den stimulierten Tieren eine dritte große Zellpopulation mit hoher Komplexität und ausgeprägter ROS-Produktionsintensität nach Stimulation mit PMA identifiziert werden. Zu den späteren Messzeitpunkten (10 Tage und 12 Wochen nach induziertem SE) konnte eine vergleichbare Population nicht beobachtet werden.

Das bedeutet, dass die stärksten Zellschädigungen aufgrund des hohen, durch Mikrogliazellen induzierten oxidativen Stresses im Gehirn nur kurzzeitig nach einem Status epilepticus zu erwarten sind. Die mikrogliale ROS-Produktionsintensität ist in der chronischen Phase, in der einzelne spontane Krampfanfälle beobachtet wurden, vergleichbar mit den Werten der Kontrolltiere.

Auf Basis dieser Messergebnisse lässt sich somit ein relativ schmales Zeitfenster zu Beginn der Epileptogenese definieren, in dem eine präventive medikamentöse Behandlung zur Verhinderung von Zellschädigungen zum Einsatz kommen könnte. Eine solche Therapie könnte aus einer Kombination von entzündungshemmenden und antioxidativen Wirkstoffen bestehen.

abstract (englisch)

Microglia seem to play a key role in the pathophysiology of epilepsy. The exact mechanism how this cell population influences the development of an epileptogenic network is still not completely understood.

Microglia activated by pathophysiological alterations can partially change their shape, proliferate and migrate to the damaged brain regions. In these regions, they release different mediators, e.g. reactive oxygen species (ROS) (Streit et al., 1988, Banati et al., 1993, Ruuls et al., 1995, Kreutzberg, 1996, Sierra et al., 2014).

The aim of the current study was to characterize the development of functional microglia alterations during epileptogenesis in a rat post-status epilepticus (SE) model by focusing on the production of ROS.

Therefore, a self-sustained SE was induced in female Sprague-Dawley rats by electrical stimulation of the right basolateral amygdala. From totally 90 animals 45 were electrically stimulated. The remaining 45 animals received a SHAM-operation and were considered as control animals. All stimulated animals developed chronic seizures during the observation period. Two days, ten days and 12 weeks after SE the animals were euthanized and microglia cells were isolated by density gradient centrifugation.

Microglial cells were identified by means of flow cytometry on the basis of their size and complexity relating to their expression of the surface markers CD11b/c+, CD18+ und CD45low. Measurements of the released amount of reactive oxygen species enabled the functional characterization of the microglial cells: the non-fluorescent dihydrorhodamin 123 (DHR) was absorbed into the cells and converts into the green fluorescent rhodamine 123 by peroxidase, which was measured by flow cytometry. In the native state and after stimulation with PMA (phorbol-myristate-acetate), the measured activity of peroxidases was used as an indicator to quantify the rate of ROS-production.

The most dominant functional microglial changes were measured in the early phase, two days after inducing status epilepticus. This was the only timepoint, when a third large microglial cell population with high complexity and distinct ROS-production upon stimulation with PMA could be identified in seizuring animals. Neither ten days nor twelve weeks after induced SE a comparable cell population with a similar increase in size and ROS-production was identified.

These findings indicate that the most severe cell damage due to high oxidative stress levels in the brain induced by microglial cells can only be expected temporarily directly after the status epilepticus. The microglial ROS-production intensity in the chronic phase during which spontaneous seizures were observed, was comparable to the results of the control animals.

Based on these results, only a relative narrow time frame at the beginning of the epileptogenesis can be defined, during which prophylactic medication could prevent cell damage. A combination of anti-inflammatory and antioxidant medication as preventive treatment, therefore, could be most effective.

keywords

Reaktive Sauerstoffspezies, Mikroglia, Epileptogenese reactive oxygen species, microglia, epileptogenesis

kb

4.028