Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Katharina Beuing

 

Auswirkungen zweier Vitrifikationsverfahren auf die morphologische und molekulare Qualität in vitro produzierter boviner Embryonen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-102775

title (engl.)

Effects of two different vitrification methods on the morphological and molecular quality of in vitro produced bovine embryos

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/beuingk_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Das Ziel der vorliegenden Studie war es den Einfluss zweier Vitrifikationsmedien auf die morphologische und molekulare Qualität boviner, in vitro generierter Embryonen zu untersuchen. Die Vitrifikation und das Auftauen von an Tag 7 expandierten Blastozysten, die aus einem Standard-IVP-System (SOFaa) stammten, erfolgte entweder mit einem Vitrifikationskit das unter anderem DMSO als Kryoprotektivum enthielt (V1, n=142; Gynemed, Lehnsahn, Deutschland), oder mit einem Kit, welches kein DMSO enthielt (V2, n=151; Origio, Berlin, Deutschland). Embryonen, die zwei weiteren Gruppen zugeordnet wurden, hatten nur Kontakt mit den jeweiligen Einfrier‑ respektive Auftaumedien, ohne tatsächlich kryokonserviert worden zu sein (KV1 - Kontakt zum DMSO-haltigen Medium der Firma Gynemed, n=107; KV2 - Kontakt zum DMSO-freien Medium der Firma Origio, n=97). Nach der Vitrifikation und dem Auftauen erfolgten weitere 48 Stunden der Kultur, um nach 24 bzw. 48 Stunden die Reexpansions- und Schlupfraten zu ermitteln.

Die Analyse der geschlüpfte Blastozysten der jeweiligen Gruppen erfolgte mittels einer Lebend-Tot-Färbung oder einer RT-qPCR. In der molekularen Analyse wurde die relative Transkriptmenge von SLC2A1, HSPA1A, IFNT2, TJP1, DSC2 und PTGS2 bestimmt. Als Standard dienten für diese Analysen nicht vitrifizierte, geschlüpfte Blastozysten (K), die weder Kontakt zu den Vitrifikationsmedien hatten noch eingefroren wurden. Die folgenden Ergebnisse konnten erzielt werden:

1.      Die in den versuchen eingesetzten Blastozysten entstammen 26 IVP‑Durchgängen. Die durchschnittliche Teilungsrate betrug 61,1 ± 6,2% (n = 2990). Die Entwicklungsrate bis zur Morula oder Blastozyste lag an Tag 7 bei 18,6 ± 4,8% (n = 906) und an Tag 8 bei 25,9 ± 6,1% (n = 1275).

2.      Nach dem Auftauen lag die Reexpansionsrate für die expandierten Blastozysten der V1-Gruppe bei 89,2 ± 5,3%, die der V2-Gruppe bei 67,0 ± 15,5%. Die Schlupfrate lag bei 62,9 ± 12,2% für die Embryonen der V1- und bei 29,4 ± 14,5% für die Embryonen der V2-Gruppe. Die Reexpansionsraten der Embryonen der KV1- bzw. der KV2-Gruppe lagen bei 90,0 ± 8,2% und 90,0 ± 15,4%, die Schlupfraten bei 69,2 ± 12,0% und 47,9 ± 17,8%. Es konnte eine statistisch signifikante Reduzierung der Reexpansions- und Schlupfrate der Embryonen der V2-Gruppe im Vergleich zu allen anderen Gruppen ermittelt werden. Des Weiteren konnte eine Reduzierung der Schlupfrate der KV2-Blastozysten im Vergleich zu den Blastozysten der KV1-Gruppe festgestellt werden.

3.      Die durchschnittliche Zellzahl lag bei den Embryonen der einzelnen Versuchsgruppen bei 119,8 ± 5,8 in der V1-Gruppe (n = 25), 123,5 ± 4,0 in der V2‑Gruppe (n = 20), 120,6 ± 4,8 in der KV1-Gruppe (n = 25), 119,0 ± 5,0 in der KV2‑Gruppe (n = 25) und 116,7 ± 4,8 in der Kontrollgruppe (n = 24). Es konnte kein statistisch signifikanter Unterschied in der Gesamtzellzahl der geschlüpften Blastozysten zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Die Lebend‑Tot‑Zellratio war bei den Embryonen der V2-Gruppe (7,8 ± 0,8) statistisch signifikant niedriger als die der V1-Gruppe (12,5 ± 0,9), der KV1-Gruppe (15,6 ± 2,1), der KV2-Gruppe (13,1 ± 1,0) und der Kontrollgruppe (17,0 ± 2,0).

4.      Die Analyse der relativen Transkriptmengen von IFNT2 und PTGS2 ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Embryonen der einzelnen Gruppen.

5.      Die Expression von SLC2A1 war in den Embryonen der V1-Gruppe signifikant niedriger als in den Embryonen der KV1- und der Kontrollgruppe.

6.      Bei der Analyse der Blastozysten der Gruppen V1 und KV2 konnten signifikant weniger TJP1-Transkripte nachgewiesen werden als in denen der Kontrollgruppe. Tendenziell waren in den Embryonen der V2-Gruppe ebenfalls weniger TJP1‑Transkripte als in den Embryonen der Kontrollgruppe darstellbar.

7.      Blastozysten, die nach dem KV2- oder dem V1-Protokol behandelt wurden, wiesen eine geringere Menge an DSC2-Transkripten auf als die Blastozysten der anderen Versuchsgruppen und der Kontrollgruppe.

8.      Die Expression von HSPA1A war in den Embryonen der V1-Gruppe statistisch signifikant niedriger als in denen der Kontrollgruppe, der V2- und der KV1-Gruppe. Die Transkriptmenge der Embryonen der KV2-Gruppe war signifikant niedriger als die der Embryonen der V2- und der KV1-Gruppe, unterschied sich jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht.

Schlussfolgernd lässt sich festhalten, dass die Vitrifikation durch Medien, welche unter anderem DMSO als Kryoprotektivum enthalten, auf morphologischer Ebene zu einer besseren Überlebensfähigkeit nach dem Auftauen führt. Die Embryonen zeigen jedoch Veränderungen auf molekularer Ebene. Bei vier der sechs untersuchten, entwicklungsrelevanten Gentranskripte konnte eine verringerte Qualität im Vergleich zu den Embryonen der DMSO-freien Gruppen festgestellt werden. Inwiefern sich diese molekularen Unterschiede auf die Überlebensfähigkeit und die Gesundheit von Kälbern auswirken, müsste in weiteren Untersuchungen ermittelt werden.

 

abstract (englisch)

The aim of the present study was to analyze the influence of two different vitrification solutions on the morphological and molecular quality of in vitro produced bovine embryos. Expanded day 7 blastocysts from a standard IVP-system (SOFaa) were either vitrified with a commercially available vitrification kit containing DMSO as a cryoprotective agent (V1, n= 142; Gynemed, Lehnsahn, Germany), or with a commercially available vitrification kit without DMSO (V2, n= 151; Origio, Berlin, Germany). Additional blastocysts were passed through the vitrification solutions without succeeding vitrification (KV1 – contact to the DMSO-containing vitrification‑solutions, n= 107; KV2 – contact to the solution without DMSO, n= 97). After thawing the blastocysts were further cultured for 48h. Reexpansion rates were documented 24h post thawing and finally 48h post thawing hatching rates were assessed. Hatched blastocycsts of all groups were either subjected to live-dead staining or the analysis of relative abundance of developmentally important gene transcripts (SLC2A1, HSPA1A, IFNT2, TJP1, DSC2 and PTGS) via RT-qPCR. As control, non vitrified blastocysts cultured until hatching were employed. The following results could be obtained:

1.      The average cleavage rate lay at 61.1 ± 6.2% (n = 2990). Development rates were 18.6 ± 4.8% (n = 906) on day 7 and 25.9 ± 6.1% (n = 1275) on day 8.

2.       After thawing re-expansion rates were 89.2 ± 5.3% among the blastocysts of the V1 group and 67.0 ± 15.5% in the V2 group. Hatching rates lay at 62.9 ± 12.2% and 29.4 ± 14.5%. Reexpansion rates for blastocysts of the KV1 group were 90.0 ± 8.2% and 90.0 ± 15.4% for those of the KV2 group. Hatching rates of the latter two groups lay at 69.2 ± 12.0% and 47.9 ± 17.8%, respectively. Significantly fewer embryos reexpanded and hatched in the V2 group compared to all other groups. Furthermore, significantly more embryos hatched in the KV2 group than in the KV1 group.

3.       Average cell numbers lay at 119.8 ± 5.8 cells in embryos of group V1 (n = 25), 123.5 ± 4.0 cells V2 (n = 20), 120.6 ± 4.8 cells in KV1 (n = 25), 119.0 ± 5.0 cells in KV2 (n = 25) and 116.7 ± 4.8 cells in the control group (n = 24). No significant differences could be detected. The live/dead ratio was significantly decreased in blastocyst of the V2 group (7.8 ± 0.8) compared to those of the V1 (12.5 ± 0.9), KV1 (15.6 ± 2.1), KV2 (13.1 ± 1.0) and the control group (17.0 ± 2.0).

4.       No significant differences could be detected regarding the expression of IFNT2 and PTGS2 among embryos of all groups.

5.       The expression of SLC2A1 was significantly reduced in embryos derived from the V1 group in comparison to those from the KV1 and the control group.

6.       A significantly lower amount of TJP1 transcripts was detected in embryos of the V1 and KV2 group compared to those blastocysts of the control group. In tendency fewer TJP1 transcripts were detected in embryos of the V2 group than in those of the control group.

7.       Compared to blastocysts of all other groups those derived from the V1 and KV2 groups had significantly fewer DSC2 transcripts.

8.       There was a statistically significantly decreased expression of HSPA1A in V1 embryos compared to those obtained from the V2, KV1 and control group. The amount of HSPA1A transcripts was significantly lower for KV2 embryos than for V2 and KV1 embryos, but there was no difference in comparison to the control group.

In conclusion, vitrification with DMSO-containing media results in an increased number of surviving embryos compared to DMSO-free media. Nevertheless, these embryos show a reduced quality at the molecular level. Four of six investigated genes which are essential of evolution an inferior quality were effected compared to embryos which have been vitrified in media without DMSO. Whether these differences in gene transcription have an effect concerning the survivability and the health of calves needs to be investigated in future studies.

 

keywords

Vitrifikation, bovine Blastozysten, Dimethylsulfoxid, vitrification, bovine blastocysts, dimethyl sulfoxide

kb

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