Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Vendula Bernet

Untersuchungen zu den Effekten einer verkürzten Inkubationsdauer mit Glyzerin und der Zugabe des bovinen Seminalplasmaproteins A1/A2 (BSP-A1/A2) vor der Kryokonservierung auf die Qualität und Fertilität boviner Spermien

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-103710

title (engl.)

Investigations of the effects of a reduced incubation time with glycerol and the addition of bovine seminal plasma protein A1/A2 (BSP-A1/A2) before cryopreservation on quality and fertility of bovine sperm

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bernetv_ws13.pdf

abstract (deutsch)

Das Ziel dieser Arbeit war, die Qualität und die Fertilität kryokonservierten bovinen Spermas nach dessen Äquilibrierung in einem glyzerinfreien bzw. glyzerinhaltigen Verdünner bzw. nach Zusatz des bovinen Seminalplasmaproteins A1/A2 zu untersuchen.

 

Im ersten Versuch wurden von 15 Bullen jeweils 3 bis 5 Ejakulate (insgesamt 57 Ejakulate) gewonnen und im Split-Sample Verfahren die Spermien mit dem glyzerinfreien Verdünner Biladyl® und dem glyzerinhaltigen Verdünner Triladyl® äquilibriert. Bei Verwendung von Biladyl® erfolgte die Glyzerinzugabe nach 24-stündiger Äquilibrierungszeit unmittelbar vor dem Abfüllen in die Pailletten bei 4°C und vor dem Einfrieren. Es wurden folgende Spermaqualitätsparameter bestimmt: Anteil der Spermien mit intakter Plasmamembran und intaktem Akrosom (PMAI), Anteil akrosomgefärbter Spermien (AF), Anteil der Spermien mit hohem Mitochondrienpotential (hMMP), Anteil überlebender Spermien in hypoosmotischem im Vergleich zu isoosmotischem Medium (ÜH), Anteil der Spermien mit defragmentierter DNA (%DFI). Ferner wurde der Anteil progressiv motiler Spermien (PMOT), die Durchschnittsgeschwindigkeit der gemittelten Bahn (VAP), die Kopfschlagfrequenz (BCF) und der Anteil morphologisch intakter Spermien (MorphN) erfasst. Die Messungen vor der Kryokonservierung erfolgten 3 Stunden nach der Verdünnung (v-3), nach 24-stündiger Äquilibrierungsphase (v-24) und nach der Glyzerinzugabe zum Biladyl® (v+Glyz). Ferner wurden die Spermien unmittelbar nach dem Auftauen (n-0h) und nach dreistündiger Inkubation bei 37°C (n-3h) beurteilt. Die Fertilität wurde anhand der Non-Return-Rate 90 Tage nach der Besamung (NRR90) bewertet. Die Verdünnung in glyzerinfreiem statt glyzerinhaltigem Verdünner vor der Kryokonservierung hatte keine Auswirkungen (p > 0,05) auf die PMAI-, BCF- und MorphN-Werte. Im Vergleich zur Verdünnervariante Triladyl® waren bei mit Biladyl® konservierten Spermien die AF-Werte erhöht (p < 0,05) und die hMMP-Werte reduziert (p < 0,05). Dagegen waren erhöhte PMOT- und VAP-Werte (p < 0,05) in glyzerinfreiem Verdünner zu beobachten. Die Glyzerinzugabe vor dem Einfrieren wirkte sich auf alle Motilitätsparameter und PMAI-Werte negativ aus (p < 0,05). Nach dem Auftauen waren erhöhte AF-Werte in Biladyl® (p < 0,05) festzustellen, hingegen war der Anteil an Spermien mit defragmentierter DNA (% DFI) gegenüber Triladyl® reduziert (p < 0,05). Auch die PMOT-30min- und PMOT-120min-Werte, die VAP-30min- sowie BCF-30min-, BCF-120min- und BCF-180min-Werte waren bei Biladyl® Spermien erniedrigt (p < 0,05). Die NRR90 lag für die Verdünnervariante Biladyl® niedriger (p < 0,05) als bei der Verwendung des Triladyl®-Verdünners. Es gab auch bullenspezifische Aspekte in Abhängigkeit vom verwendeten Verdünner. Bei einem Bullen nach Anwendung von Biladyl® war die NRR90 erhöht, bei einem anderen Bullen war sie erniedrigt. Keine signifikanten Effekte des Verdünners waren auf die Fertilität bei anderen Bullen zu verzeichnen.

Die Glyzerinzugabe nach 24-stündiger Äquilibrierungszeit übte mehr nachteilige Effekte auf die Spermaqualität aus als eine Spermaäquilibrierung im glyzerinhaltigen Verdünner. Deshalb ist weiterhin das einstufige Verdünnerverfahren im Kryokonservierungsprozess der bovinen Spermien als Methode der Wahl anzusehen.

 

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das BSP-A1/A2 (SPP) zu den nativen Ejakulaten vor dem Kryokonservierungsprozess zugesetzt. Insgesamt wurden für diesen Versuch 28 Ejakulate von 6 Bullen (jeweils 4 bis 5 Ejakulate) verwendet. Es wurden ein Ansatz ohne SPP und drei Versuchsansätze mit Konzentrationen von 1000 µg SPP/ml, 2000 µg SPP/ml und 3000 µg SPP/ml Ejakulat hergestellt. Für den Besamungsversuch wurde die Konzentration von 2000 µg SPP/ml Ejakulat gewählt und die Fertilität anhand der NRR90 erfasst. Die Analysen der Samenproben erfolgten vor der Kryokonservierung, unmittelbar nach dem Auftauen (0h) und nach 3-stündiger Inkubation bei 37°C (3h). Vor der Kryokonservierung zeigten die Konzentrationen 1000 µg- und 3000 µg SPP/ml Ejakulat einen negativen Einfluss auf die PMAI- und AF-Werte (p < 0,05). Die Konzentration 3000 µg SPP/ml reduzierte zusätzlich die ÜH- und PMOT-Werte (p < 0,05) im Vergleich zum Kontrollansatz. Nach der Kryokonservierung waren die AF-0h-Werte bei Konzentrationen von 1000 und 3000 µg SPP/ml erhöht (p < 0,05). Die SPP Zugabe von 3000 µg/ml führte zum Abfall der ÜH-0h- und ÜH-3h-Werte (p < 0,05) sowie zu einem Anstieg der DFI-0h-Werte (p < 0,05) im Vergleich zur Kontrollprobe. Die PMOT-Werte waren gegenüber der Kontrolle beim Ansatz 3000 µg SPP/ml reduziert (p < 0,05) und zwar unmittelbar nach dem Auftauen als auch nach 3-stündiger Inkubation. Die Konzentrationen 2000 und 3000 µg SPP/ml führten im Vergleich zur Kontrolle zu einer Abnahme der LIN-0h-Werte (p < 0,05). Nach dreistündiger Inkubation waren die VAP-3h-, BCF-3h- und LIN-3h-Werte (p < 0,05) in den 1000 und 3000 µg/ml SPP Ansätzen gegenüber dem Kontrollansatz reduziert. Der SPP Zusatz in der Konzentration  2000 µg/ml führte im Vergleich zur Kontrolle lediglich zu einem Abfall der LIN-Werte (p < 0,05). Es wurden auch tierindividuelle Unterschiede hinsichtlich des Effekts einer SPP Zugabe festgestellt. Die Differenz in der Fertilität zwischen den Varianten war nicht signifikant. Bei einem Bullen wurde eine Verschlechterung der NRR90 (p < 0,05) bei der SPP Variante beobachtet. Da die Zugabe von BSP-A1/A2 die Qualität und die Fertilität kryokonservierter boviner Spermien negativ beeinflusst, ist sie nicht zu empfehlen.

 

Eine Verbesserung der Qualität und der Fertilität kryokonservierter bovinen Spermien konnte nach dessen Äquilibrierung in einem glyzerinfreien Verdünner bzw. nach Zusatz von BSP-A1/A2 nicht erreicht werden.

abstract (englisch)

The aim of this study was to assess the quality and fertility of cryopreserved bovine sperm after equilibration in the glycerol-free extender and glycerol-containing extender, respectively, and after addition of the bovine seminal plasma protein A1/A2.

 

In the first trial each of 15 bulls 3-5 ejaculates were collected (overall 57 ejaculates) and in a split-sample procedure sperm were equilibrated by using a glycerol-free extender (Biladyl®) and a glycerol-containing extender (Triladyl®). To the semen samples diluted with glycerol-free extender (Biladyl®) glycerol was added after 24h equilibration and immediately before filling into straws at 4°C and freezing. The following sperm quality parameters were determined: percentage of sperm with intact plasma membrane and intact acrosome (PMAI), percentage of sperm with acrosome staining (AF), percentage of sperm with high mitochondrial potential (hMMP), percentage of viable sperm in hypo-osmotic compared to those in iso-osmotic medium (ÜH), percentage of sperm with elevated DNA fragmentation index (%DFI). Furthermore, the percentage of progressively motile sperm (PMOT), the velocity average path (VAP), the beat cross frequency (BCF) and the percentage of morphology intact sperm (MorphN) were detected. Measurements before cryopreservation were carried out 3h after dilution (v-3), after 24h equilibration (v-24) and after glycerol addition to Biladyl® (v+Glyz). In addition, the sperm quality was assessed directly after thawing (n-0h) and after 3h incubation at 37°C. The fertility was evaluated on the basis of the Non-Return-Rate 90 days after insemination (NRR90). Dilution in the glycerol-free extender instead of the glycerol-containing extender before cryopreservation had no effects (p > 0,05) on PMAI-, BCF- and MorphN-values. In comparison to Triladyl® the AF-values were higher (p < 0,05) and hMMP-values lower (p < 0,05) in Biladyl®. However, higher PMOT- and VAP-values (p < 0,05) were observed in glycerol-free extender. The glycerol addition before cryopreservation had a negative effect on all sperm motility parameter and PMAI-values (p < 0,05). After thawing sperm diluted in Biladyl® showed higher AF-values (p < 0,05), but lower %DFI-values (p < 0,05) compared with sperm diluted in Triladyl®. Likewise PMOT-30min- and PMOT-120min values as well as VAP-30min values and BCF-30min-, BCF-120min- and BCF-180min values were lower (p < 0,05) in sperm cryopreserved with Biladyl®. The NRR90 was lower (p < 0,05) in sperm diluted in Biladyl® extender. By using Biladyl® one bull showed a higher and one bull a lower NRR90. All other bulls showed no differences in fertility in relation to the type of extender. In general, the glycerol addition after an equilibration time of 24 hours has more negative effects on sperm quality than the equilibration with a glycerol-containing extender immediately after collection of semen. Therefore, the one-step dilution is recommended for cryopreservation of bovine sperm.

 

In the second trial the BSP-A1/A2 (SPP) was added to ejaculates before cryopreservation. For this experiment overall in 28 ejaculates from 6 bulls (4 to 5 ejaculates in each of the bulls) were collected. One aliquot without SPP and three aliquots with concentrations of 1000 µg SPP/ml, 2000 µg SPP/ml and 3000 µg SPP/ml ejaculate were prepared. For the insemination trial 2000 µg SPP/ml ejaculate were used and fertility was estimated by the parameter NRR90. Measurements took place before cryopreservation, directly after thawing (0h) and after samples were incubated at 37°C for 3 hours (3h). The concentrations 1000 and 3000 µg SPP/ml ejaculate showed negative effects on PMAI- and AF-values (p < 0,05) before cryopreservation. The concentration 3000 µg SPP/ml reduced additionally ÜH- and PMOT-values (p < 0,05) compared to control samples. After cryopreservation AF-0h-values were higher (p < 0,05) at concentrations of 1000 and 3000 µg SPP/ml. The addition of 3000 µg/ml led to a reduction of ÜH-0h- and ÜH-3h values (p < 0,05) as well as to an increase in DFI-0h-values (p < 0,05) compared to control samples. PMOT-values at 0h and 3h after cryopreservation were lower (p < 0,05) in samples with 3000 µg SPP/ml than in control samples. Sperm samples with 2000 and 3000 µg SPP/ml showed lower LIN-0h values (p < 0,05) than control samples. After three hours incubation VAP-, BCF- and LIN-values of frozen thawed sperm were lower (p < 0,05) in samples with 1000- and 3000 µg SPP/ml compared to samples without addition of SPP. The addition of SPP at 2000 µg/ml concentration caused only a reduction in LIN-3h values (p < 0,05) compared with the control sample. Individual differences with respect to the addition of seminal plasma protein were detected. Overall, there was no dif­ference (p > 0,05) in NRR90 data between samples with different concentrations of seminal plasma protein. Only semen of one bull cryopreserved after the addition of SPP showed lower NRR90 values (p < 0,05). As the supplementation of BSP-A1/A2 protein had generally negative effects on quality and fertility of bovine cryopreserved sperm, this method can not be recommended.

 

The quality and fertility of cryopreserved bovine sperm after equilibration in glycerol-free extender and after addition of the BSP-A1/A2, respectively, could not be improved.

keywords

Bullensperma, Glyzerin, Seminalplasmaprotein; bull sperm, glycerol, seminal plasma protein

kb

636