Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Sandra Milena Bernal Ulloa

 

 Experimental studies into the role of cAMP in bovine oocyte maturation and embryo developmental competence

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-107858

title (ger.)

Experimentelle Untersuchung zur Bedeutung von cAMP in der Oozytenreifung und Embryonenentwicklung beim Rind

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bernalulloas_ss16.pdf

abstract (deutsch)

In dieser Studie wurde die Wirkung von cAMP modifizierenden Substanzen auf die Entwicklungskompetenz boviner präpuberaler und adulter Eizellen in zwei experimentellen Ansätzen untersucht. Im ersten Ansatz wurden zweimal wöchentlich über fünf Wochen von 66 präpuberalen und 66 adulten Spendern mit Hilfe von Ultraschall-geleitetem Ovum-pick-up (OPU) Oozyten gewonnen. Die gewonnenen Oozyten wurden zufällig auf drei Behandlungsgruppen verteilt: TCM24 (24h IVM/Kontrolle), cAMP30 (2h pre-IVM (Forskolin-IBMX) und 30h IVM mit Cilostamid) und DMSO30 (Dimethylsulfoxid/Vehikel Kontrolle). Nach IVM wurden die Oozyten in vitro befruchtet und die Zygoten in vitro bis zum Blastozystenstadium kultiviert. Die meiotische Progression, der cAMP-Spiegel, die mRNA Expression ausgewählter Gene und die DNA-Methylierung der Satellite I und α Sequenzen wurden in Oozyten analysiert. Blastozysten wurden für Genexpressions- und DNA-Methylierungsanalysen verwendet. Blastozysten aus den cAMP30 Gruppen wurden auf Empfängertiere übertragen. Erhöhte cAMP-Spiegel nach einer pre-IVM in der cAMP30 Behandlungsgruppe verzögerten die meiotische Progression. Allerdings waren die embryonalen Entwicklungsraten nach IVF nicht erhöht. In der DMSO30 Behandlung wurde eine beschleunigte meiotische Wiederaufnahme und verringerte Embryonenentwicklung beobachtet. Die mRNA-Expression für PRKACA war bei unreifen Oozyten in der cAMP30 Gruppe höher; jedoch keine Unterschiede wurden für PDE3A, SMAD2, ZAR1, PRDX1 und SLC2A8 gefunden. Die relativen Expressionslevel der genannten Gene unterschieden sich nicht nach der IVM. Das EGR1 Transkript-Profil war bei unreifen präpuberalen Eizellen aus der cAMP30 Gruppe erhöht und in expandierten Blastozysten aus allen in vitro-Behandlungen herunterreguliert im Vergleich zu der jeweiligen Kontrolle. Es wurden keine Unterschiede in der mRNA Expression für DNMT3b, BCL2L1, PRDX1 und SLC2A8 in expandierten Blastozysten gefunden. Die Satelliten-DNA-Methylierungsmuster unterschieden sich nicht in unreifen Eizellen. In der cAMP30 Behandlungsgruppe konnte eine Hypermethylierung bei beiden Satellitensequenzen in gereiften Eizellen beobachtet werden. Das Satellite DNA Methylierungsmuster der Blastozysten von präpuberalen und adulten Eizellspendern aus der cAMP30 Gruppe glich dem der in vivo generierten Blastozysten. In der TCM24- und DMSO30-Behandlungsgruppe wurden abormale DNA-Methylierungsprofile detektiert. Nach Transfer von Embryonen aus präpuberalen und adulten Spendertieren (cAMP30) wurden ähnliche Trächtigkeitsraten erreicht und gesunde Nachkommen geboren. Im zweiten Versuchsansatz wurden eine zweistündige pre-IVM mit oder ohne Koffein Zusatz (0, 1, 5, 10, 20, 30 mm) und eine Standard-Kontrollbehandlung durchgeführt. Die Eizellen dafür wurden aus Schlachthofovarien durch Slicen gewonnen. Die meiotische Progression und die cAMP-Spiegel wurden in den Oozyten analysiert. Teilungs- und Blastozystenraten wurden bei allen Behandlungsgruppen ausgewertet. Die Blastozysten wurden ferner einer Differentialfärbung unterzogen. Expandierte Blastozysten aus der 10 mM Koffein Behandlungsgruppe und der Standardbehandlung wurden vitrifiziert. Es konnte eine konzentrationsabhängige Wiederaufnahme der Meiose in den Koffeingruppen beobachtet werden. Dabei waren aber die cAMP-Spiegel nicht erhöht. Nach Zugabe von 30 mM Koffein waren die Entwicklungsraten drastisch verringert. Die Raten in den anderen Behandlungsgruppen waren ähnlich. Nach Vitrifikation, Auftauen und anschließender 48-stündiger Kultur wurden in der 10 mM Koffein Behandlungsgruppe sowohl signifikant höhere Schlupfraten als auch ein erhöhter Anteil lebender Zellen an der Gesamtzellzahl im Vergleich zur Standard-Kontrollgruppe ermittelt.

Zusammenfassend ist zu sagen, dass cAMP erhöhende Mittel, die eingesetzt werden um die spontane Eizellenreifung zu minimieren, verschiedene Pathways modulieren, die in der Oozytenreifung eine wichtige Rolle spielen, was wiederum das Entwicklungspotential von Oozyten und Embryonen positiv beeinflusst.

abstract (englisch)

To determine the effects of cAMP increasing agents on prepubertal and adult oocyte competence, we performed two different experimental approaches using the bovine model. In the first approach, 66 prepubertal and 66 adult donors were submitted to transvaginal ultrasound guided oocyte recovery (OPU) twice per week for a total of 5 weeks. Three different treatments were implemented for oocyte retrieval and in vitro maturation (IVM) in both types of donors: TCM24 (24h IVM/control), cAMP30 (2h pre-IVM (forskolin-IBMX) plus 30h IVM with cilostamide supplementation), and DMSO30 (Dimethyl Sulfoxide/vehicle control). After IVM, oocytes were fertilized in vitro and zygotes were cultured in vitro to the blastocyst stage. Meiotic progression, cAMP levels, mRNA abundance of selected genes and DNA methylation were evaluated in oocytes. Blastocysts were used for analyses of gene expression and DNA methylation. Blastocysts from the cAMP30 groups were transferred to recipients. Increased cAMP levels after pre-IVM in the cAMP30 treatment delayed meiotic progression. However, developmental rates were not increased. Accelerated meiotic resumption and decreased embryo development were observed in the DMSO30 treatment. The relative mRNA abundance for PRKACA was higher in immature oocytes using the cAMP30 protocol. No differences were found for PDE3A, SMAD2, ZAR1, PRDX1 and SLC2A8. Similar gene expression patterns were observed for the same genes after IVM. Early growth response 1 (EGR1) transcript was higher in prepubertal cAMP30 immature oocytes and down-regulated in blastocysts derived from all in vitro treatments compared to the in vivo counterparts. No differences were found for DNMT3b, BCL2L1, PRDX1 and SLC2A8 in expanded blastocysts, irrespective of the type of the donor. Satellite DNA methylation patterns in immature oocytes did not differ among treatments irrespective of type of donor, but levels were higher for adult oocytes from the cAMP30 treatment in both satellite sequences. Satellite DNA methylation levels in blastocysts obtained from adult and prepubertal donors were similar compared to their in vivo produced counterparts when cAMP regulators had been supplemented prior to IVM. However, aberrant methylation profiles were observed in blastocysts after TCM24 and DMSO30 treatment. After embryo transfer, similar pregnancy rates were obtained with embryos derived from both types of donors and healthy offspring were born. The second experimental approach included a 2h pre-IVM with or without caffeine (0, 1, 5, 10, 20, 30 mM) and a standard control treatment. Oocytes were retrieved from ovaries via slicing. Meiotic progression and cAMP levels were evaluated in oocytes. Cleavage and blastocyst rates were evaluated in all treatments. Blastocysts were submitted to differential staining. Expanded blastocysts from the 10 mM caffeine and standard treatments were vitrified. Although resumption of meiosis was delayed in a concentration-dependent manner, cAMP levels were not increased. Developmental rates were dramatically decreased when 30 mM caffeine had been supplemented prior to IVM, whereas rates were similar among other treatments. Forty eight hours after warming, hatching rates and the proportion of live/total cells were significantly higher in the 10 mM caffeine treatment group compared with the standard control. In summary, these results indicate that cAMP increasing agents, used to alleviate oocyte spontaneous maturation, modulate different pathways in oocytes during in vitro maturation, which in turn may improve oocyte and embryo developmental competence.

keywords

zyklisches AMP, in vitro Reifung, Rinderoozyten, cyclic AMP, in vitro maturation, bovine oocytes

kb

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