Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Johanna Bennemann

 

Experimentelle Untersuchungen zur Ermittlung des Einflusses der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten auf die globale DNA-Methylierung in Zygoten nach In-vitro-Fertilisation (IVF)

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-102764

title (engl.)

Experimental studies to investigate the impact of different oxygen tensions during in vitro maturation on global DNA methylation of in vitro fertilized bovine zygotes

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bennemannj_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss der Sauerstoffkonzentration während der In-vitro-Reifung boviner Oozyten auf die globale DNA-Methylierung in vitro produzierter Zygoten zu ermitteln.

Im Rahmen der Vorversuche erfolgte die Etablierung eines immunzytochemischen Protokolls sowie der Auflicht-Fluoreszenzmikroskopie zur Darstellung und quantitativen Analyse des 5-Methylcytosins in in vitro produzierten Zygoten des Rindes auf globaler Ebene. Hierzu wurden sowohl Zygoten als auch Zwei-, Vier- und Achtzellstadien aus der In-vitro-Produktion verwendet. Für eine optimale Bindung des Antikörpers an die methylierten Cytosinmoleküle ist ein Verdau der Zona pellucida notwendig. Die Ermittlung einer geeigneten Inkubationszeit der Embryonen in der sauren Tyrode-Lösung hatte zum Ziel, einen möglichst vollständigen Verdau der Zona pellucida bei einer gleichzeitig spezifischen Darstellung der DNA-Methylierung zu gewährleisten. Die Erstellung von Verdünnungsreihen des Primär- und Sekundärantikörpers diente der Bestimmung einer optimalen Konzentration der Immunglobuline für eine bestmögliche Darstellung des 5-Methylcytosins. Weiterhin wurden in jedem Versuchsdurchlauf eine erste und zweite Negativkontrolle sowie eine Isotypkontrolle angefertigt. 

Im Anschluss an die Etablierung des immunzytochemischen Protokolls fand die Etablierung einer Methode zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes der zuvor immunzytochemisch gefärbten Zygoten statt. Das Fluoreszenzsignal der DNA diente bei der Quantifizierung der Methylierungen der DNA einer Normalisierung des 5-Methylcytosin-Fluoreszenzsignals. Von großer Bedeutung war die Ermittlung einer Salzsäurekonzentration, die zum einen eine für die Bindung des Primärantikörpers an das Antigen 5-Methylcytosin essentielle Denaturierung der DNA bewirkte, zum anderen aber auch eine Darstellung der Nukleinsäuren in ihrer Gesamtheit mit einem Fluoreszenzfarbstoff ermöglichte. DAPI, Propidiumiodid, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Ethidium Homodimer-1 sowie Ethidium Homodimer-2 stellen die sechs erprobten Fluoreszenzfarbstoffe dar, die alle bereits für eine Darstellung des Gesamtgehaltes an Nukleinsäuren in präimplantatorischen Embryonen beschrieben wurden.

In den Hauptversuchen erfolgte schließlich die Prüfung eines Einflusses der Sauerstoffkonzentration (5 % und 20 %) während der In-vitro-Maturation boviner Oozyten auf die globale DNA-Methylierung in den aus der In-vitro-Reifung- und Befruchtung hervorgegangenen Zygoten. Dazu wurden einige Embryonen dem immunzytochemischen Protokoll unterzogen, während andere das Protokoll zur Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes mit Hoechst 33342 durchliefen. Die quantitative Analyse der Fluoreszenzsignale erfolgte mithilfe der ImageJ-Software. Die Fluoreszenzintensitäten der Vorkerne der immunzytochemisch gefärbten Zygoten galten als Maß für den Methylierungsgrad der DNA, die Fluoreszenzintensitäten der Pronuklei der mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 gefärbten Zygoten als Maß für den DNA-Gehalt des Embryos. Insgesamt wurden 1270 Zygoten aus 9 IVP-Sitzungen im Rahmen der Hauptversuche einer quantitativen Analyse ihrer Fluoreszenzsignale unterzogen, von denen schließlich 379 Zygoten mithilfe der ImageJ-Software ausgewertet wurden. 

Die durchgeführten Untersuchungen konnten folgende Ergebnisse erzielen:

1. Eine vollständige Digestion der Zona pellucida der Zygoten war mit den erprobten Inkubationszeiten in der sauren Tyrode-Lösung nicht möglich. Eine zu lang andauernde Inkubation der Embryonen in dem sauren Milieu erschwerte die Generierung spezifischer Fluoreszenzsignale der Methylierungen der DNA in den Vorkernen. Die zweiminütige Inkubationszeit der Zygoten in der sauren Tyrode-Lösung bei 37°C erwies sich für eine partielle Digestion der Zona pellucida bei gleichzeitig optimaler immunzytochemischer Darstellung des 5-Methylcytosins als geeignet.

2. Durch die Erstellung von Verdünnungsreihen konnten die optimalen Einsatz-Konzentrationen des Primär- und Sekundärantikörpers ermittelt, unspezifische Bindungen reduziert und somit eine spezifische Darstellung des 5-Methylcytosins in der DNA ermöglicht werden.

3. Die Anfertigung von Kontrollen in jedem Versuchsdurchlauf erwies sich für die Aussagekraft der Ergebnisse als essentiell. Durch die erste Negativkontrolle konnten unspezifische Bindungen des Sekundärantikörpers ausgeschlossen werden. Die zweite Negativkontrolle diente dem Ausschluss einer Autofluoreszenz der Zygoten. Die Isotypkontrolle stellte sicher, dass der Primärantikörper keine unspezifischen Bindungen einging.

4. Die Darstellung des Gesamtgehaltes der DNA der Zygoten im Anschluss an eine Denaturierung war mit den Fluoreszenzfarbstoffen DAPI, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Ethidium Homodimer-1 und Ethidium Homodimer-2 nicht möglich.

5. Die Darstellung des Gesamt-DNA-Gehaltes der Zygoten nach einer Denaturierung war mit dem Fluoreszenzfarbstoff Propidiumiodid nicht reproduzierbar.

6. Die In-vitro-Reifung der Kumulus-Oozyten-Komplexe bei 5 % O2 resultierte im Vergleich zu den bei 20 % O2 maturierten KOK in einem kompakteren, weniger expandierten Kumulus.

7. Die Befruchtungsraten nach einer Reifung in vitro bei 5 % O2 waren verglichen mit einer Maturation bei 20 % O2 erniedrigt. Im Falle eines Ausbleibens der Befruchtung kam es nicht zur Formation der beiden parentalen Pronuklei, welche somit auch nicht mit dem Fluoreszenzfarbstoff Hoechst 33342 nachgewiesen werden konnten. Stattdessen erfolgte die Anfärbung der DNA im Zellkern der Oozyte. 

8. Zwischen den normalisierten 5mC-Signalen der maternalen und paternalen Pronuklei der bei 5 % O2 in vitro gereiften Oozyten konnten statistisch signifikante Unterschiede festgestellt werden. Die paternalen Pronuklei wiesen ein signifikant höheres 5mC-Signal auf.

9. Die normalisierten 5mC-Signale der maternalen und paternalen Pronuklei der bei 20 % O2 in vitro gereiften Oozyten unterschieden sich nicht statistisch signifikant voneinander.

10. Die normalisierten Fluoreszenzsignale des 5-Methylcytosins der maternalen Pronuklei beider Reifungsgruppen unterschieden sich statistisch signifikant voneinander. Die maternalen Pronuklei der bei 20 % O2 gereiften Eizellen wiesen ein signifikant höheres Fluoreszenzsignal auf.

11. Die normalisierten Fluoreszenzsignale der paternalen Vorkerne beider Maturationsgruppen unterschieden sich nicht statistisch signifikant voneinander.

12. Die normalisierten relativen Methylierungen der paternalen Pronuklei beider Reifungsgruppen unterschieden sich statistisch signifikant voneinander. Die bei 5 % O2 gereiften Oozyten wiesen eine signifikant höhere normalisierte relative Methylierung auf.

Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen eine erhöhte Widerstandsfähigkeit der Zona pellucida boviner Zygoten gegenüber einer Digestion mit saurer Tyrode-Lösung durch eine In-vitro-Kultur vermuten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Einsatz sorgfältig geprüfter Konzentrationen der Antikörper sowie die Anfertigung von Kontrollen in jedem Versuchsdurchlauf für die immunzytochemische Darstellung des 5-Methylcytosins essentiell sind. Dass eine Darstellung des Gesamt-Gehaltes der DNA im Anschluss an eine Denaturierung mit ausgewählten Fluoreszenzfarbstoffen nicht möglich ist, weist auf den Vorgang der Denaturierung und die dadurch bedingte Einzelsträngigkeit der DNA als Ursache für die nicht spezifische Bindung der Farbstoffe hin.

Das geringere Ausmaß der Kumulusexpansion sowie die niedrigeren Befruchtungsraten nach einer In-vitro-Reifung bei 5 % O2 verglichen mit einer Maturation bei 20 % O2 weisen auf eine Beeinträchtigung des Befruchtungsvorgangs durch die reduzierten Sauerstoffkonzentrationen während der Reifung in vitro hin.

Weiterhin ist anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zu erkennen, dass eine In-vitro-Reifung boviner Oozyten bei 5 % O2 eine Reduktion der globalen Methylierung des maternalen Genoms in vitro produzierter Zygoten bewirkt. Um zu erkennen, ob der globale Verlust an Methylierungen im maternalen Genom der Zygoten auch mit veränderten Genexpressionsmustern sowie einer Beeinflussung der Entwicklung der betroffenen Individuen assoziiert ist, sind weiterführende Untersuchungen zur Identifizierung der betroffenen Sequenzen sowie eine Genexpressionsanalyse notwendig.

 

abstract (englisch)

The aim of the present study was to investigate the effect of different oxygen tensions during in vitro maturation of bovine oocytes on global DNA methylation of in vitro produced zygotes.

In preliminary experiments an immunocytochemical protocol for visualization and quantitative analysis of global 5-methylcytosine methylation in in vitro produced bovine zygotes was established. Zygotes as well as two-, four- and eightcell-embryos derived from in vitro production were used. Optimum binding of the antibodies to methylated cytosines requires digestion of zona pellucida. Evaluation of adequate incubation time of the embryos in acidic Tyrode’s solution targeted a preferably complete digestion of the zona pellucida and simultaneous specific staining of DNA methylation. Dilution series of primary and secondary antibody aimed to identify optimal concentrations of the immunoglobulins for visualization of 5-methylcytosine at the best. Furthermore, each run contained a primary and secondary negative control and an isotype control.

Thereafter, a method for staining the total embryonic DNA amount was established. The fluorescence signal of DNA was used for normalization of 5-methylcytosine fluorescence signal in the context of quantification of DNA methylation. The identification of an adequate hydrochloric acid concentration was of importance, causing a denaturation of DNA which was essential for the binding of the primary antibody to 5-methylcytosine, but which was also suitable for visualization of the entire amount of nucleic acids by staining with a fluorescent dye. DAPI, Propidiumiodid, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Ethidium Homodimer-1 and Ethidium Homodimer-2 were tested.

The main experiments were conducted to investigate the effect of oxygen tension (5 % and 20 %) during bovine oocyte in vitro maturation on global DNA methylation of in vitro produced zygotes. For this purpose one half of the embryos underwent the immunocytochemical staining and the other half was stained with Hoechst 33342 to measure the total amount of DNA. Quantitative analysis of fluorescence signals was performed with the ImageJ program. The fluorescence intensities of immunocytochemically stained pronuclei served as a measure for the degree of DNA methylation, those obtained pronuclei stained with Hoechst 33342 were indicators for the amount of DNA. In total, quantitative analysis of fluorescence signals were assessed in1261 zygotes derived from 9 IVP-sessions.

The following results could be obtained:

1. Complete digestion of the zona pellucida was not possible with the tested incubation times in acidic Tyrode’s solution. Exposure of the embryos to the acidic environment for too long impeded the generation of specific fluorescence signals of methylated DNA. Incubating the zygotes in acidic Tyrode’s solution for two minutes at 37°C was suitable for partial digestion of zona pellucida and simultaneous optimal immunocytochemical image acquisition of 5-methylcytosine.

2. Dilution series resulted in optimal concentrations of primary and secondary antibody, reduced unspecific binding of the immunoglobulins and enabled specific presentation of 5-methylcytosine in DNA.

3. Controls in each run were essential for validity and specificity of results. Primary negative control served to exclude unspecific binding of secondary antibody. Secondary negative control made sure that autofluorescence of the embryos didn’t influence results. Isotype control excluded unspecific binding of primary antibody.

4. Following denaturation, visualization of total DNA amount of zygotes with fluorescent dyes DAPI, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Ethidium Homodimer-1 and Ethidium Homodimer-2 was not possible.

5. Following denaturation, visualization of total DNA amount of zygotes with Propidiumiodid was not reproducible.

6. In comparison to COC matured at 20 % oxygen, cumulus-oocyte-complexes matured at 5 % oxygen displayed a more compact, less expanded cumulus.

7. Fertilisation rates were reduced following in vitro maturation at 5 % oxygen compared to maturation at 20 % oxygen.

8. Normalized 5-methylcytosine signals differed significantly between maternal and paternal pronuclei of oocytes matured in vitro at 5 % oxygen. Paternal pronuclei showed a significantly greater signal.

9. Normalized 5-methylcytosine signals did not differ significantly between maternal and paternal pronuclei of oocytes matured in vitro at 20 % oxygen.

10. There was a significant difference of normalized fluorescence signals of 5-methylcytosine between maternal pronuclei of oocytes matured at 5 % oxygen and 20 % oxygen. Following maturation at 20 % oxygen, maternal pronuclei of zygotes displayed a significant greater fluorescence signal.

11. Maturation at 5 % oxygen and 20 % oxygen did not cause significant differences of normalized fluorescence signals of paternal pronuclei.

12. There was a significant difference in normalized relative methylation of paternal pronuclei subsequent to maturation in vitro at 5 % and 20 % oxygen. Oocytes matured in vitro at 5 % oxygen displayed a significant greater normalized relative methylation level.

The obtained results hypothesize an increased resistance of bovine zygotes’ zona pellucida to digestion with acidic Tyrode’s solution by in vitro culture. Furthermore this study shows the necessity of using accurately tested antibody concentrations as well as negative controls in each run for immunocytochemical visualization of 5-methylcytosine. Failure in using selected fluorescent dyes for measuring total DNA amount following denaturation suggests single stranded DNA status caused by denaturation to be the cause for non-specific binding of theses dyes to DNA.

Cumulus expansion to a lesser extent as well as decreased fertilization rates following in vitro maturation at 5 % oxygen compared to maturation in vitro at 20 % oxygen hypothesizes an impaired fertilization prozess caused by reduced oxygen tension during in vitro maturation.

Furthermore results demonstrate a reduction of global methylation level of the maternal genome in in vitro produced bovine zygotes derived from in vitro maturation at 5 % oxygen. To detect whether the decrease in global methylation of the maternal genome of zygotes is associated with changes in gene expression and whether it affects the development of individuals, further analyses for identification of involved sequences and gene expression studies are required.

 

keywords

DNA-Methylierung, In-vitro-Maturation, Sauerstoffkonzentration, DNA methylation, in vitro maturation, oxygen tension

kb

2.266