Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Karelle Bénardais

 

Modulation of the blood-brain barrier

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-102750

title (ger.)

Modulation der Blut-Hirn-Schranke

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/benardaisk_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Die Blut-Hirn-Schranke, dessen wesentlicher Bestandteil die Endothelzellen sind, limitiert die freie, parazelluläre Diffusion von wasserlöslichen als auch von pathogenen Substanzen. Diese Barriereeigenschaft wird ihr insbesondere durch ein dichtes und lückenloses Netzwerk an sogenannten „tight junctions“ (syn. Schlussleiste, Zonula occludens) ermöglicht, die sich überwiegend aus dem Claudin-5-Protein zusammensetzen. Die Integrität dieser natürlichen Barriere kann i.R. von Erkrankungen gestört sein, wie z.B. während einer aktiven Läsion bei der Multiplen Sklerose (MS) und mit Veränderungen der Struktur und Expression von Proteinen einhergehen, welche die „tight junctions“ letztlich bilden.

Die MS ist eine chronisch-entzündliche, demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems, die sich darüber hinaus durch eine unvollständige Remyelinisierung als auch axonalem Schaden/Untergang kennzeichnet. Ihre Ätiologie ist unbekannt. Spekuliert werden Umweltfaktoren und/oder eine genetische Prädisposition. Eine Heilung ist nicht möglich, aber es existieren mittlerweile einige medikamentöse Therapien, die sich in der Behandlung fest etablieren konnten. Die kürzlich erteilten Genehmigung als eines neuen oralen Verbindung ermöglicht Dimethlyfumarat (DMF), um das therapeutische Arsenal verlängern. Die Ergebnisse der Phase-III-Studie bzgl. dieser Substanz sind vielversprechend und zeigen, dass DMF prospektiv die Anzahl neuer Läsionen als auch den axonalen Untergang effektiv reduziert. Interessanterweise ist wenig über die Wirkweise dieser Substanz bekannt. Neben neuroprotektiven Eigenschaften, die über den sogenannten nuclear-factor (erythroid derived 2) related factor-2 (Nrf2)-Signalweg vermittelt würden, werden auch immunmodulatorische Fähigkeiten derzeit diskutiert.

Immunmodulatorische Eigenschaften werden bei einem völlig anderen Behandlungskonzept, nämlich der Transplantation von mesenchymalen Stammzellen (MSC), ebenso diskutiert, wobei die Daten hier noch auf Phase-I/II-Studien basieren und, im Gegensatz zu DMF, eine klinische Anwendung noch nicht mit Sicherheit vorhergesagt werden kann. Heutzutage existieren zahlreiche Tiermodelle, die zum Verständnis verschiedener Teilaspekte der MS beigetragen haben. Das wichtigste und am häufigsten verwendete Tiermodell für die MS ist die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), die auf einer aktiven Immunisierung von Mäusen mit ZNS-Gewebe, wie z.B. Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG), basiert. Im Gegensatz zum EAE-Modell bietet das toxische bis-cyclohexylidenehydrazide (Cuprizon)-Mausmodell die Möglichkeit, unabhängig von einer primär-peripheren Immunantwort die De- und Remyelinisierung zu untersuchen. Hierzu werden Mäuse mit dem Kupfer-Chelator Cuprizon gefüttert, was zu einer massiven Demyelinisierung im Gehirn, die im Corpus Callosum besonders ausgeprägt ist, führt. Obgleich der genaue Mechanismus dieses Chelators noch unbekannt ist, so bewirkt sie eine Apoptose von Oligodendrozyten, die durch eine starke Mikrogliose und Astrogliose begleitet wird. Die Blut-Hirn-Schranke bleibt während und nach der Cuprizon-Behandlung stets intakt.

Die Zielsetzung des ersten Projekts der vorliegenden Arbeit war es, den toxischen Einfluss von Cuprizon auf die Zellen im Hirn zu untersuchen. Hierfür verwendeten wir primäre Rattengliazellkulturen sowie eine Neuroblastom-Zelllinie (SH-SY5Y). Dieser experimentelle Ansatz ergab, dass Cuprizon insbesondere auf die reifen und vollständig differenzierten Oligodendrozyten ausgeprägt toxisch wirkt.

Das zweite Projekt verfolgte das Ziel, den Einfluss von Dimethylfumarat (DMF) auf zerebro-endothelialetight junctions“ in vitro als auch in vivo zu untersuchen. Hinsichtlich der in vitro Experimente benutzten wir eine humane, immortalisierte und endotheliale Zellinie (hCMEC/D3), mit welchem ein In-vitro-Modell der Blut-Hirn-Schranke quasi generiert wurde. Die hCMEC/D3-Zellen wurden dann entweder vor oder nach einer Dimethylfumarat-Behandlung mit dem Tumornekrosefaktor-α (TNFα) behandelt. TNFα ist ein inflammatorisches Zytokin und zerstört die Integrität der Blut-Hirn-Schranke, womit die Situation der Blut-Hirn-Schranke während einer Entzündung simuliert wurde. Wir untersuchten mittels der Western-Blot-Technik und Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion nach Veränderungen in der Expression von Proteinen der „tight junction“ und insbesondere des Nrf2-Proteins. Unsere In-vivo-Experimente führten wir mit C57BL/6-Mäusen durch, die mit Dimethylfumarat gefüttert und bei denen im Anschluss mit MOG eine EAE induziert wurden. Zusammengefasst konnten wir weder in den In-vitro- noch in den In-vivo-Experimenten einen Einfluss von Dimethlyfumarat auf die Proteine der „tight junctions“ feststellen.

Das dritte Projekt befasste sich mit dem Thema, ob mesenchymale Stammzellen überhaupt in der Lage sind, in das ZNS einzudringen und einen begünstigenden Einfluss auf die Regeneration im Falle des toxischen Cuprizon-Mausmodells zu nehmen. Hierzu wurden Cuprizon-gefütterten Tieren nach vier Wochen, ein Zeitpunkt massiver Mikroglia-Aktivierung und Demyelinisierung, entweder markierte Mesenchymzellen oder, als Kontrolle, Fibroblasten intranasal oder venös verabreicht. So die intravenös injizierten humanen MSC (hMSC) befanden sich ausschließlich in den Blutgefäßen. Die mesenchymalen Stammzellen beider Spezien sammelten sich allerdings in der Lunge, wohingegen wir in den Cuprizon-bedingten Hirnläsionen keine MSC beobachtet haben und auch keine Veränderungen während der Remyelinisierung beobachten konnten.

Das vierte Projekt zielte darauf ab, den Einfluss einer perinatal abgelaufenen Entzündung auf eine im adulten Alter auftretende Demyelinisierung hin zu untersuchen und Veränderungen hinsichtlich der Blut-Hirn-Schranke aufzudecken. In zwei verschiedenen experimentellen Ansätzen wurde eine systemische bakterielle Entzündung durch die Injektion von Lipopolysaccharid, entweder prä- oder postnatal, simuliert. Eine durch Cuprizon vermittelte Demyelinisierung wurde dann im adulten Alter bei den Tieren ausgelöst. Wir benutzten immunhistochemische Methoden, um das Myelin und die gliale Reaktion zu quantifizieren. Die postnatale LPS-Injektion führte zu einer Reduktion der Anzahl aktivierter Mikroglia im Corpus Callosum, verzögerte die Demyelinisierung und beschleunigte die frühe Remyelinisierung, was mit einer gesteigerten Anzahl an reifen Oligodendrozyten einherging. Interessanterweise führte die perinatale LPS-Injektion zu einer Reduktion der Anzahl Claudin-5-positiver Gefäße, welche allerdings unabhängig von der Cuprizone-Gabe war.

Zusammengefasst konnten wir demonstrieren, dass Cuprizon toxisch hinsichtlich reifer Oligodendrozyten ist. DMF führte weder in vitro noch in vivo zu Veränderungen bzgl. der „tight-junction“-Proteine und mesenchymale Stammzellen sind nicht in der Lage, ins Hirngewebe einzudringen. Die perinatal erworbene Blut-Hirn-Schrankenstörung wird bis ins adulte Alter fortgeführt und begünstigt den Cuprizon-vermittelten Ablauf, indem es die Demyelinisierung verzögert und die frühe Remyelinisierung beschleunigt.

 

abstract (englisch)

Mainly composed of cerebral endothelial cells (EC), the blood-brain barrier (BBB) limits the free paracellular diffusion of water-soluble molecules or pathogenic agents. This is possible by the presence of an elaborate network of tight junctions (TJ) including the claudin-5 protein, in the interendothelial cleft. Accordingly, several in vitro models exist and a well characterised one is certainly the immortalised human brain endothelial cell line (hCMEC/D3). In multiple sclerosis (MS), the integrity of BBB is impaired and alterations in the expression and structure of the TJ proteins are common in active demyelinating lesions. MS is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), defined by inflammation-mediated demyelination, axonal loss and incomplete remyelination. Although so far no definite cure is available, several therapies have been proven helpful. Data of a recent phase III clinical trial of dimethylfumarate (DMF) treatment, administered orally, reveal that this substance reduces axonal loss and the emergence of new lesions. Its mode of action is yet not clear, but both neuroprotective, via the nuclear-factor (erythroid derived 2) related factor-2 (Nrf2) detoxifying pathway, and immunomodulatory mechanisms are being discussed. DMF has been recently accredited and considered to be an important expansion of the therapeutic arsenal. Immunomodulatory effects are also discussed in another concept of therapy, namely the transplantation of mesenchymal stem cells (MSC). However, the data are based on a phase I/II clinical trial and a therapeutic use remains elusive. It is known that perinatal inflammation impacts the BBB. During the early life of animal, a mild inflammation leads to a BBB permeability increase and may cause white matter damage. Nowadays, different animal models are available to study specific aspects of MS pathogenesis, such as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the most frequently used model. EAE can be induced by immunisation with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) generating an autoimmune response which leads to the myelin loss. To study de- and remyelination in the CNS, the cuprizone [bis (cyclohexylidenehydrazide)] induced toxic demyelination, where the BBB is not damaged, is certainly a favoured model. In this model, mice are fed with the copper chelator cuprizone, which leads to oligodendrocytes death with subsequent demyelination accompanied by a strong microgliosis and astrogliosis.

The underlying mechanisms of cuprizone induced oligodendrocytes death are still unknown and appropriate in vitro investigations to study these complex mechanisms are not available. Thus, we first examined the cuprizone effects on primary rat glial cell cultures and on the neuroblastoma cell line SH-SY5Y. We observed in particular that the differentiated mature oligodendrocytes are significantly and specifically affected by cuprizone mediated toxicity.

The transcription factor Nrf2 has been suggested to be important for the integrity of the BBB. The aim of the second study was to investigate DMF on brain endothelial TJ proteins in vitro as well as in vivo. The hCMEC/D3 cells were treated with DMF pre- or post-stimulated with tumor necrosis factor (TNF)α, known to disrupt the BBB. Changes in the expression level of Nrf2 and TJ proteins were evaluated by Western blot and real-time PCR. In vivo, DMF was given orally to C57BL/6 mice suffering from MOG-induced EAE. We could show that DMF does not have any effects on the TJ proteins of the BBB in both models.

As MSC could create an environment which promotes regeneration in the CNS, the third project intended to found out whether MSC are able to migrate into CNS lesions and which consequences they cause at the cellular level. After four weeks of cuprizone feeding (time of massive microglial activation and demyelination), murine and human MSC were labelled and were injected into the mice through the nose or the vein. As a control, we used fibroblast cells. The intravenously injected hMSC were found rarely in the blood vessels or under the meninges of the brain. Both, mMSC and hMSC, intravenously injected, accumulated in the lungs. However, none of the MSC were detected in brain lesions and the administration of MSC did not affect the demyelination.

Finally, the aim of the fourth and last project was to determine the long-term effects of perinatal inflammation on BBB changes and on a demyelination event in adulthood. In two different sets of experiments, a systemic bacterial inflammation was mimicked by the injection of lipopolysaccharide (LPS), either prenatal or postnatal. Demyelination was then induced when the animals entered adulthood. Immunohistochemistry was used to quantify myelination and glial reactions. In this regard, postnatal LPS injections decreased the number of activated microglia in the corpus callosum and delayed demyelination. Moreover, LPS enhanced early remyelination going along with an increased number of mature oligodendrocytes. Interestingly, perinatal LPS injections significantly reduced the number of claudin-5 positive vessels, which was independent of cuprizone administration.

Altogether, we demonstrated that cuprizone is particularly toxic for mature oligodendrocytes. DMF neither displayed in vitro nor in vivo effects on claudin-5 TJ proteins of the BBB. Murine and human MSC are not able to migrate into the brain lesions. The perinatal acquired BBB disruption seems to be maintained in the adulthood and with respect to the cuprizone induced demyelination, it surprisingly exhibits beneficial effects.

 

keywords

Blut-Hirn-Schranke, Cuprizone, lipopolysaccharide, Blood-brain barrier, cuprizone, lipopolysaccharide

kb

4.019