Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Tanja Bauer

 

Vorkommen von Shigatoxin-bildenden und enteropathogenen Escherichia coli in deutschen Streichelzoos

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-102742

title (engl.)

Occurrence of shigatoxin-producing and enteropathogenic Escherichia coli in German petting zoos

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bauert_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Unter den humanpathogenen Darm- und Durchfallerregern spielen STEC/EPEC mittlerweile v.a. in den Industriestaaten eine immer größer werdende Rolle. Bei STEC/EPEC handelt es sich um den Darmkomensalen Escherichia coli, der jedoch im Fall von STEC/EPEC oder EHEC durch das Beherbergen von Virulenzfaktoren zu einem pathogenen Erreger wurde. Unzählige, meist durch diverse Lebensmittel ausgelöste Epidemien, die nicht selten Todesopfer fordern, sind in der Literatur beschrieben. Häufig liegt der Ursprung solcher Krankheitsausbrüche jedoch auch im engen Kontakt des Menschen zu großen und kleinen Wiederkäuern. Diese Tierspezies gelten als symptomlose Reservoirtiere und können STEC/EPEC auf den Menschen übertragen. Besonders gefährdet an schweren Folgeerkrankungen wie HUS (hämolytisch urämisches Syndrom) oder TTP (Thrombotisch-thrombozytopenische Purpura) zu erkranken sind sog. YOPIs (junge, alte, schwangere und immunsuppremierte Menschen). Da in Streichelzoos v.a. die Risikogruppe der Kinder vertreten ist, sollte in dieser Studie das Vorkommen in solchen Einrichtungen untersucht werden. Ziel dieser Arbeit war eine Prävalenzerhebung von STEC/EPEC in deutschen Streichelzoos sowie das Eruieren von eventuellen Faktoren, die das STEC-Vorkommen in den Reservoirtieren erhöhen bzw. Risikofaktoren welche eine Übertragung auf den Menschen potenzieren.

Dazu wurden zunächst 126 Tierparks um ihre Teilnahme an dem Projekt gebeten. Aus arbeitstechnischen, personellen sowie Kostengründen konnte ein Maximum von 50 Zoos (40% der angeschriebenen Zoos) deutschlandweit beprobt werden. Von den angefragten Parks nahmen 56 teil, somit wurde das mögliche Maximum deutlich erreicht. Um die Ergebnisse später auf ganz Deutschland zu projizieren und eventuelle Störvariablen zu kontrollieren, wurden die Parks, nach Ermittlung der regionalen Zoodichte, je nach Betriebsstruktur in zoologische Gärten, Wildparks und Freizeitparks mit Tieranteil unterteilt. Außerdem wurde Deutschland in drei Regionen (Region 1, 2 und 3) unterteilt. Von jeder Parkart sollten nun 40% in jeder der drei Regionen beprobt werden. Die Beprobungen begannen für das Jahr 2008 im Mai und endeten Ende August (24 Zoos). Im Jahr 2009 dauerten sie von April bis Mitte Oktober (32 Zoos) an. Alle Parks wurden zweimal im Abstand von zwei Wochen beprobt. Die zu ziehende Stichprobengröße wurde individuell anhand der hypergeometrischen Verteilung mit einer Sicherheitswahrscheinlichkeit (1-α) von 95% und einer angenommenen Prävalenz (P) von 20% berechnet. Die insgesamt 1558 Proben (1517 Kotproben und 41 Insektenproben) aus beiden Jahren wurden im Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover weiter bearbeitet. Zusätzlich wurden die Parkbetreiber mittels eines Fragebogens über die Gehegehygiene und das Gehegemanagement, den Gesundheitsstatus der Tiere sowie der Besucherverpflegung befragt. Die Fragebögen wurden anschließend mit Hilfe des Statistikprogramms SAS ausgewertet.

Die Proben aus dem Jahr 2008 wurden mittels immunomagnetischer Separation mit O157 serogruppenspezifischen Beads und mPCR auf die Virulenzgene Intimin (eaeA), Hämolysin A (hlyA), Shigatoxin 1 (stx1) sowie Shigatoxin 2 (stx2) untersucht. Von den 566 Sammelkotproben waren sieben Proben (1,2%) aus drei verschiedenen Parks (12,5%) STEC positiv. Die 17 untersuchen Insektenproben waren STEC/EPEC-negativ. Die vom Robert-Koch Institut vorgenommene Serotypisierung der Isolate ergab die Serogruppe O157 eines Kaninchenisolates aus Park 105 mit allen getesteten Virulenzgenen. Die Schafisolate aus Park 110 und die Ziegenisolate aus Park 107 waren nicht typisierbar (Ont). Die Isolate aus Park 107 beherbergten die Virulenzgene stx1, stx2 sowie hlyA. Die Isolate aus Park 110 trugen die Virulenzfaktoren stx2 und hlyA. Alle STEC-positiven Parks waren der Kategorie „Wildpark“ zugeordnet.

Die 975 Proben aus dem Jahr 2009 wurden ebenfalls mittels immunomagnetischer Separation vorangereichert. Allerdings wurde die IMS aufgrund neuer wissenschaftlicher Erkenntnisse um vier weitere serogruppenspezifische Beads erweitert (O26, O103, O111 und O145). Nach einer Screening-PCR wurden die mittels Colony-Hybridisierung gewonnen Isolate in einer Kontroll-PCR auf die Virulenzgene stx1, stx2 und eae getestet. Auch 2009 waren alle 24 Insektenproben STEC-negativ. In 27 der 32 untersuchten Parks konnte STEC/EPEC in Kotproben nachgewiesen werden, das entspricht einer Prävalenz von 84,4% der 2009 untersuchten Zoos. In der Screening-PCR waren 309 (31,7%) Probenabschwemmungen positiv für mindestens eines der getesteten Virulenzgene. Insgesamt wurden 297 Isolate aus 201 Proben zur Serotypisierung an das Robert-Koch Institut weitergeleitet. Es konnten 32 verschiedene Serogruppen aus sechs verschiedenen Tierarten (Ziege, Schaf, Rind, Schwein, Lama, Damwild) identifiziert werden. Zu den häufigsten isolierten Serogruppen auf Probenebene gehörten O146 (16,9%), O76 (16,4%) und O26 (10,4%). Die größte Serogruppenvariabilität konnte bei Ziegen und Schafen, sowie bei Schweinen aufgezeigt werden. Am häufigsten wurde bei den Ziegen auf Probenebene O76 (13,9%), bei den Schafen O146 (5,5%) und bei den Schweinen O103 (2,5%) detektiert. Betrachtet man die Virulenzgene der gewonnen Isolate auf Probenebene, so konnte stx1 in 96 Proben als häufigstes Virulenzgen, gefolgt von eae (59 Proben) sowie stx1 in Kombination mit stx2 (59 Proben), detektiert werden. Auf Zooebene wurde eae in 68,8% der Parks besonders oft nachgewiesen. Das Vorkommen dieser Virulenzgene in dieser Häufigkeit und in diesen Kombinationen konnte von anderen Studien bisher nicht aufgezeigt werden.

Sowohl 2008 als auch 2009 wurden jeweils zu etwa gleichen Teilen (ca. 30%) Parks in der Region 1, 2 sowie Region 3 beprobt. Bei den 2008 als STEC-positiv identifizierten Parks handelte es sich um drei Wildparks. Ein signifikanter Zusammenhang zum Vorkommen von STEC/EPEC in Wildparks zeigte sich verglichen mit zoologischen Gärten (p=0,0227). Die positiven Parks stammten aus Region 2 und 3. Das Kaninchenisolat der Serogruppe O157 stammte aus der Region 2. Im Jahr 2009 konnten STEC/EPEC positive Parks in allen drei Regionen und in jedem Zootyp detektiert werden. Somit konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Vorkommen von STEC/EPEC und der Region oder dem Zootyp festgestellt werden.

Das Gehegemanagement unterschied sich in allen 56 Parks nur unwesentlich und hatte keinen Einfluss auf das Vorkommen von STEC/EPEC. Lediglich Parks, in denen der Tierpfleger selbst landwirtschaftliche Nutztierhaltung betrieb, waren 2009 signifikant (p=0,0033) weniger STEC/EPEC-positiv. Möglicherweise sind diese Tierpfleger was die Infektions- und Seuchengefahr betrifft sensibilisierter, was evtl. zu einer besseren Hygiene und somit geringerer Reinfektion der Tiere führt. Die Gehege wurden zum größten Teil (87,5%) täglich, jedoch sowohl Ställe als auch Ausläufe zu über 80% nur trocken gereinigt. Ein Handwaschbecken für Besucher in unmittelbarer Nähe zum Streichelgehege gab es erfreulicherweise in über der Hälfte (53,6%) der untersuchten Zoos, doch leider werden die Besucher nur in 12,5% auf die Möglichkeit des Händewaschens hingewiesen. Allerdings ist eine abschließende Beurteilung z.B. der Erregerverschleppung innerhalb des Zoos sowie die Übertragung auf Besucher nicht möglich, da weder Nichtstreicheltiere noch Besucher bezüglich STEC/EPEC untersucht wurden.

Abschließend bleibt zu sagen, dass in Anbetracht der jährlichen Besucherzahlen und den bisher nur wenigen nachgewiesenen Infektionen, die tatsächlich auf einen Besuch im Streichelgehege zurückzuführen sind, die Infektionsgefahr in deutschen Streichelzoos trotz der hohen STEC/EPEC-Prävalenz relativ gering ist. Die gewissenhafte Einhaltung einiger einfacher Hygieneregeln seitens der Besucher wird dafür jedoch vorausgesetzt. Die sachliche Aufklärung und Sensibilisierung der Besucher sowie Tierpfleger gegenüber Zoonoserisiken ist Aufgabe des Parkbetreibers und sollte in den meisten deutschen Streichelzoos verbessert werden. Die vorliegende Arbeit ist die bisher umfangreichste durchgeführte Studie zur Erhebung des STEC/EPEC-Vorkommens in deutschen Streichelgehegen. Auch wenn in diesen Untersuchungen keine signifikanten regionalen, den Zootyp betreffenden oder Gehegemanagement bedingten Unterschiede bezüglich des STEC/EPEC-Vorkommens belegt werden konnten, so sind die gewonnenen Ergebnisse trotz des Methodenwechsels zumindest bedingt auf die STEC/EPEC-Situation in den gesamten deutschen Streichelzoos übertragbar.

 

abstract (englisch)

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and enteropathogenic E. coli (EPEC) play an important role as causative agents of diarrhoea in humans with increasing relevance particularly in the industrial states. STEC/EPEC are descendants of commensal E. coli, which gained pathogenicity by acquisition of virulence factors. The majority of outbreaks is considered to be food-associated and numerous epidemics including fatal diseases in humans have been reported. In addition, close contact to ruminants is described to be a potential source of STEC/EPEC infections. Ruminants serve as clinically healthy reservoir hosts of these pathogens and may transmit it to humans. Young, old, pregnant and immunocompromised patients (YOPIs) are known to be at higher risk for exacerbated and often fatal courses of STEC infections, such as the haemolytic-uraemic syndrome (HUS) or the thrombotic-thrombocytopenic purpura (TTP). In petting zoos children may come into close contact with STEC/EPEC reservoir species, such as sheep and goats. Thus, the aim of the study was to determine the STEC/EPEC prevalence in petting zoos and to analyse risk factors influencing its occurrence, as well as the possibility of transmission.

For this purpose 126 animal parks were contacted. Due to restrictions in time and financial capacities, a maximum of about 50 parks, equalling about 40% of the originally contacted parks, was intended to be tested. In total, 56 parks participated in the study. To control for interfering variables and to allow extrapolation of the results for whole Germany, parks were divided into three categories: zoological gardens (zoos), wild parks and amusement parks with animal husbandry. Furthermore, Germany was divided into three regions (region 1, region 2 and region 3). The aim for each region and category was to include 40% of the originally contacted zoos in the study. The study was divided into two sampling periods, with period 1 (24 zoos) ranging from May to August 2008 and period 2 (32 zoos) lasting from April to October 2009. Each park was sampled twice in an interval of two weeks. Pooled faecal samples and insects were collected, cooled and transported to the laboratory of the Institute for Microbiology, University of Veterinary Medicine Hanover, as quickly as possible. Survey sample sizes were calculated for each park and animal species according to the herd size, using the hypergeometric distribution with a level of confidence (1-α) of 95% and an assumed prevalence (P) of 20%. In total, 1,558 samples (1,517 faecal samples and 41 insect samples) were analysed. The park direction answered a questionnaire about the compound hygiene, the compound management as well as the health situation of the petting animals and the attendees fare. The questionnaires were analysed by the statistics program SAS.

In 2008 (sampling 1) E. coli cultures were enriched for serogroup O157 by immunomagnetic separation with specific antibodies prior to cultivation. Selected colonies were tested for the presence of intimin (eae), haemolysin A (hlyA), shigatoxin 1 (stx1) and shigatoxin 2 (stx2) genes by multiplex polymerase chain reaction (mPCR). STEC was isolated from seven out of 566 faecal samples (1.2%) originating from three different parks (12.5%; n=24). No STEC was isolated from 17 insect samples. Serotypes of all Isolates were determined by the Robert-Koch Institute (RKI). One isolate from a rabbit from park 105 was identified as serogroup O157 and carried all virulence genes tested. Isolates from sheep from zoo 110 and goats from park 107 were serologically not typeable. The isolates from zoo 110 possessed virulence genes stx2 and hlyA, while isolates from park 107 were positive for stx1, stx2 and hlyA. All STEC positive parks belonged to the category “wild parks”.

In 2009 (sampling 2) the immunomagnetic separation was modified to enrich for serogroups O26, O103, O111 and O145 in addition to O157. STEC strains of these genotypes are commonly associated with disease in humans and bead-conjugated antibodies specific for their O-antigens had become commercially available. The enriched cultures were screened for the presence of stx1, stx2 and eae by mPCR (screening PCR). For PCR-positive samples individual STEC/EPEC colonies were selected by colony-hybridisation for stx1, stx2 and eae genes. The presence of these genes in the isolates was confirmed by mPCR (colony PCR). Again all insect samples (n=24) were negative for STEC/EPEC. In contrast, 309 out of 975 faecal samples (31.7%) were tested positive for at least one virulence gene in the screening PCR. Positive samples originated from 27 out of 32 parks (84%) and six different animal species (goat, sheep, cattle, pigs, lama and fallow deer). The maximal proportion of positive samples within an individual park was as high as 80%. A total of 291 STEC/EPEC isolates from 201 different samples were serotyped by the RKI and at least 32 different serogroups were identified. Most prevalent serogroups were O146 (16.9% of all samples with serotyped isolates; n=201), O76 (16.4%) and O26 (10.4%). Serogroup O76 had the broadest geographical distribution, since it was present in five out of ten postal code zones in Germany and the predominant serogroup in three of these areas. The highest serotypical variability was observed in sheep and goats with 22 detected serogroups each. Seven different serogroups were isolated from pigs. The predominant serogroups in goats, sheep and pigs were O76 (13.9% of all samples with serotyped isolates; n=201), O146 (5.5%) and O103 (2.5%), respectively. The virulence genes eae, stx1 and stx2 were detected in 68.8%, 65.6% and 46.9% of all parks, respectively. Isolates carrying only stx1 were detected in 96 positive samples, followed by eae alone (59 samples) and the combination of stx1 and stx2 (59 samples). This is the first study to report these high prevalences of STEC/EPEC isolates with these virulence gene combinations.

Since STEC/EPEC are known to be shed intermittently by their reservoir host, sampling of each park was repeated two weeks later to reduce false negative result. In 2009 five out of 27 positive parks were found positive in only one of the two samplings. Analysis of serotypes revealed repeated isolation of the same serotypes in some of the parks, although sometimes in different host species. In some parks, in which STEC/EPEC was isolated from some host species, other species kept in parallel remained negative during both samplings.

In both sampling periods (2008 and 2009) approximately equal proportions of parks from the three regions (about 30% each) were tested. All three parks tested STEC-positive in 2008 belonged to the category “wild parks” and originated from regions 2 and 3. The STEC/EPEC detection rate in “wild parks” was significantly higher as compared to zoological gardens during this sampling period. In contrast, in 2009 parks from all categories and regions were tested positive and no significant differences in detection rates were observed. Serogroup O157 was detected in a park in region 2 in 2008 and two parks in regions 1 and 3 in 2009.

No remarkable differences were observed between the petting zoo managements of the tested parks, regardless of their affiliation to the categories of zoological gardens, wild parks or amusement parks and factors determining the risk for STEC/EPEC infections in a park were not identified. Only the employment of animal caretakers which are privately keeping farming animals was significantly associated with a decreased STEC/EPEC detection rate (p=0.0033). It may be speculated, that these animal caretakers were more aware of the risks of infections and epidemic plaques. This awareness may have improved hygiene measures and thereby reduced STEC/EPEC re-infection rates. The petting zoo enclosures were cleaned daily in the majority of parks (87.5%), but in more than 80% of the parks only dry cleaning of both stables and outer parts of the enclosures was performed. Wash-hand basins were available for the visitors in more than half of the petting zoos (53.6%). However, the possibility of hand washing was announced to the visitors by signs in only 12.5% of the parks. A final analysis of STEC/EPEC transmission within zoos or between petting animals and visitors is not possible, since neither visitors nor zoo animals other than those in the petting zoos were tested during this study.

Only few human STEC/EPEC infections related to petting animals have been described so far. Thus, it can be concluded that the risk of transmission to visitors is low, despite the high STEC/EPEC prevalence in petting animals in Germany detected in this study. However, the careful performance of simple hygiene measures, such as hand washing after contact to the animals, appears necessary to maintain the low risk of transmission. To inform visitors and animal caretakers about possible risks of zoonotic infections is part of the responsibility of the park direction. The results of this study have shown that this communication needs to be improved in most German petting zoos.

This work comprises the most extensive study performed on the presence of STEC/EPEC in petting zoos in Germany. In summary, no significant differences between prevalences in different park categories or German regions have been observed. Management factors influencing the STEC/EPEC detection rates were not observed. Nevertheless, the results of this study can be extrapolated to the STEC/EPEC situation in petting zoos throughout Germany, despite the use of different diagnostic methods during the two sampling periods of this study.

 

keywords

Streichelzoo, STEC/EPEC, Prävalenz, Petting zoo, STEC/EPEC, prevalence

kb

2.214