Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Jens Bankstahl

 

Untersuchungen von Mechanismen der Pharmakoresistenz in Status epilepticus-Modellen

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-96280

title (engl.)

Investigations of mechanisms underlying pharmacoresistance in status epilepticus models

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2008

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/bankstahlj_ws08.pdf

abstract (deutsch)

Ein therapieresistenter Status epilepticus (RSE) ist eine medizinische Notfallsituation, in der bereits Antiepileptika der ersten als auch der zweiten Wahl versagt haben. Er ist mit einer hohen Mortalität und einer großen Zahl an Folgeerkrankungen vergesellschaftet. Ein besseres Verständnis der einem RSE zugrunde liegenden Mechanismen ist notwendig, um seine Entstehung zu verhindern oder einen bestehenden RSE zu beenden.

Sowohl in klinischen Untersuchungen als auch in tierexperimentellen Studien hat sich gezeigt, dass ein SE, der mehr als 30 Minuten andauert, nur sehr schwer abzubrechen ist. Eine Erklärung hierfür sind Veränderungen am GABAA-Rezeptor, die eine geringere Wirksamkeit von Benzodiazepinen verständlich machen. Allerdings ist allein durch Veränderungen am GABAA-Rezeptor nicht erklärbar, warum auch Antiepileptika, die an anderen Zielstrukturen angreifen, nicht wirken. Dies ließe sich durch Veränderungen an Transportsystemen an der Blut-Hirn-Schranke erklären. Die dort exprimierten Multidrug-Transporter transportieren Antiepileptika, wie z. B. Phenobarbital oder Phenytoin, die zur Behandlung eines SE klinisch verwendet werden. Für den Multidrug-Transporter P‑Glycoprotein (Pgp) wurde in chronischen Epilepsie-Modellen eine Beteiligung an der Ausbildung einer Pharmakoresistenz nachgewiesen. Bisher existiert keine prädiktive diagnostische in‑vivo-Methode, um die Funktion von Pgp im Patienten oder im Tiermodell darzustellen. Ein möglicher Ansatz stellt die Nutzung der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) dar.

Hauptziel dieser Arbeit war zum einen, zu untersuchen, ob Veränderungen der Pgp-Expression als Mechanismus eines RSE eine Rolle spielen. Hierzu wurden zwei Ratten-SE-Modelle pharmakologisch charakterisiert und danach die Expression von Pgp bestimmt. Zum Zweiten sollte durch die Entwicklung eines PET-Protokolls die Wirkung von Pgp-Hemmstoffen der neuesten Generation sichtbar gemacht werden, um so einen Assay für funktionelle Untersuchungen von Resistenzmechanismen zu schaffen. Für die pharmakologische Charakterisierung eines chemisch und eines elektrisch induzierten SE-Modells wurde die Wirkung der Antiepileptika Phenytoin, Phenobarbital und Diazepam an Ratten untersucht. Hierbei wurde keine zeitabhängige Veränderung der antikonvulsiven Wirkung der Antiepileptika gefunden. Allerdings ließen sich deutliche Unterschiede in der Wirkung der Antiepileptika zwischen den Modellen darstellen. Pgp war während des SE in seiner Expression weder verändert, noch ließ sich durch Gabe des selektiven Pgp-Inhibitors Tariquidar eine Wirkungsverbesserung der Antiepileptika erzielen. Pgp scheint also nicht an der Ausbildung der Pharmakoresistenz in einem SE beteiligt zu sein. Als weiteres Ergebnis zeigte sich hinsichtlich der antiepileptischen Wirksamkeit eine deutliche Überlegenheit der Kombination von Phenobarbital und Diazepam gegenüber den einzeln eingesetzten Substanzen oder anderen Kombinationen.

Zwei Tage nach dem SE konnte hingegen in beiden Modellen eine deutliche Erhöhung der Pgp-Expression um bis zu 60% erfasst werden. Parallel zu dieser Expressionserhöhung wurde eine signifikante Verringerung der Gesamtgehirnkonzentration von Phenytoin, gemessen als Gehirngewebe-Plasma-Verhältnis, im Hippocampus festgestellt, was eine mögliche funktionelle Auswirkung dieser Überexpression darstellt. Im Gegensatz dazu wurde nach Mikrodialyse-Untersuchungen im Extrazellulärraum des Gehirns keine Veränderung gefunden.

Zur Etablierung einer in-vivo-Methode zur Messung der Pgp-Funktion wurde ein PET-Protokoll mit dem Tracer (R)-11C-Verapamil etabliert. In naiven Ratten wurden wiederholte Scans vor, während und nach der Applikation des selektiven Pgp-Inhibitors Tariquidar aufgenommen. Hierbei konnten neue pharmakokinetische Informationen gewonnen werden, die für weitere Untersuchungen in Epilepsie-Modellen wichtig sein werden. Tariquidar verursachte in einer Dosierung von 15 mg/kg eine 12-fache Erhöhung der Gehirnkonzentrationen von (R)-11C-Verapamil. Diese Erhöhung wurde zum größten Teil durch einen vermehrten Einstrom über die Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn verursacht, der durch die Geschwindigkeitskonstante K1 beschrieben wird. Die maximale Wirkung von Tariquidar hatte sich nach etwa 30 Minuten eingestellt. Zudem konnte eine vorläufige Dosis-Wirkungs-Kurve mit einer ED50 von 6,5 mg/kg berechnet werden.

Die Untersuchungsergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis der Mechanismen bei, die der Entwicklung einer Pharmakoresistenz zugrunde liegen und können helfen, neue Konzepte zur Epilepsietherapie zu entwickeln.

 

abstract (englisch)

Refractory status epilepticus (RSE) is a major emergency with a failure of both first and second anticonvulsant treatments and the consequence of high mortality and various co-morbidities. Better understanding of underlying mechanisms will help to prevent or reverse RSE.

Both in clinical trials and in animal experiments a decrease in effectiveness of antiepileptic drugs has been found if an SE lasts more than 30 minutes. Alterations in the GABAA-receptor are a possible explanation for the decreased effectiveness of benzodiazepines. Nevertheless, changes in one target structure cannot be the only explanation why antiepileptic drugs interacting with other targets are not effective. In addition to target alterations, changes in transport systems at the blood-brain-barrier may be involved in the resistance to antiepileptic drugs (including phenytoin and phenobarbital) that are transporter substrates. These multidrug transporters, such as P-glycoprotein (Pgp), have been shown to be involved in the pharmacoresistance of an animal model of chronic epilepsy, in which the application of a selective Pgp-Inhibitor led to a complete reversal of the refractoriness. In addition, today there is no predictive diagnostic in-vivo-method for the evaluation of the Pgp-function in patients or animal models. Postrion-emission-tomography (PET) could be useful for this purpose.

Main object of this thesis was to investigate, if changes in expression of Pgp are involved in RSE. For this intention, we pharmacologically characterized two animal models of SE in rats and quantified the expression of Pgp. Second, we generated a PET-protocol in order to measure the effect of newest generation Pgp-inhibitors and to functionally investigate mechanisms of pharmacoresistance.

The effectiveness of antiepileptic drugs, like phenytoin and phenobarbital, was used for the pharmacological evaluation of electrically and chemically induced rat-SE-models. Even though we found no time-dependant changes in anticonvulsant efficacy, we detected apparent differences in the overall effectiveness in the two models. Pgp expression was neither changed over a SE-duration of up to eight hours, nor was the effectiveness of antiepileptic drugs improved after application of the selective Pgp-inhibitor tariquidar. Overall, Pgp seems not to be involved in drug resistance of SE. In addition, we could show predominance in anticonvulsant effectiveness of the combined application of phenobarbital and diazepam over single application or other combinations.

In contrast to the lack of Pgp changes during SE, 48 hours after SE we found Pgp-overexpression of up to 60% in both SE-models. Simultaneously, a significant reduction of phenytoin brain concentrations, measured by brain-plasma-ratio, was located in the hippocampus, which could be a consequence of Pgp-overexpression. However, we found no changes in hippocampal extracellular concentrations of phenytoin, quantified by microdialysis.

For the investigation of the functional activity of Pgp at the blood-brain-barrier in rats, we used small-animal PET and (R)-11C-verapamil together with tariquidar. We obtained novel kinetic information about effects of tariquidar in naïve animals, measured by repeated PET-Scans. We found a 12-fold increase in (R)-11C-verapamil in the brain two hours after administration of 15 mg/kg tariquidar, which was mainly caused by an increase of the influx rate constant K1. Tariquidar achieved maximal effects 32 minutes after administration. Furthermore, we could calculate a preliminary dose-response-function with an ED50 of 6.5 mg/kg.

The present results will help to better understand mechanisms underlying pharmacoresistance in epilepsy and will hopefully lead towards new therapeutic concepts of treating pharmacoresistant epilepsy.

 

keywords

(3 dt. + 3 engl.)

Epilepsie, Pharmakoresistenz, Transporter; P-glycoprotein, pharmacoresistance, status epilepticus

kb

3.439