Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Mahdi Amiri

The role of N-butyl deoxynojirimycin in enzyme function, membrane association and targeting of brush border hydrolases

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-105353

title (ger.)

Der Einfluss von N-Butyl-Deoxynojirimycin auf die Enzymfunktion, Membranassoziierung und Zielsteuerung von Hydrolasen der Bürstensaummembran 

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2014

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/amirim_ws14.pdf

abstract (deutsch)

N-Butyl-Deoxynojirimycin (NB-DNJ) ist ein oral angewendetes Medikament zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten wie das Gaucher-Syndrom und Niemann-Pick Typ C. Gastrointestinale Unverträglichkeiten, zum Beispiel Durchfall, Blähungen und Übelkeit, sind die häufigsten Nebenwirkungen von NB-DNJ. Es wird vermutet, dass diese Symptome eine Folge der Suppression der intestinalen Kohlenhydratverdauung durch NB-DNJ sind. Ähnlich wie bei Erkrankungen mit Disaccharidase Defizienz, erhöhen die unverdauten und nicht absorbierten Kohlenhydrate den osmotischen Einstrom von Wasser und Elektrolyten in den Darm. Die Kohlenhydrate werden anschließend im Colon durch Bakterien fermentiert wobei die die Symptome auslösenden Substanzen entstehen.

Im vorliegenden Projekt haben wir die Rolle von NB-DNJ als Auslöser der gastrointestinalen Intoleranzen über zwei Ansätze untersucht:

1) Aufklärung der unmittelbaren Effekte von NB-DNJ auf die enzymatische Funktion der intestinalen Disaccharidasen Sucrase-Isomaltase (SI), Laktase-Phlorizin-Hydrolase (LPH) und Maltase-Glucoamylase (MGA).

2) Analyse der chronischen Langzeiteffekte von NB-DNJ auf die intestinalen Enzymfunktionen, welche durch Veränderungen in der Proteinfaltung, der intrazellulären Prozessierung, des Proteintransportes und der Zielsteuerung der Disaccharidasen durch NB-DNJ hervorgerufen werden.

Wir konnten zeigen, dass NB-DNJ, als unmittelbaren Effekt, die Kohlenhydratmaldigestion im intestinalen Lumen besonders durch Inhibition der α-glycosidischen Aktivität der intestinalen Disaccharidasen SI und MAG verursacht. Die beobachtete Hemmung ist eine Kombination aus kompetitiver und unkompetitiver Hemmung. Laktase, eine β-Galactosidase, wird nur teilweise bei hohen, nicht-physiologischen Konzentrationen von NB-DNJ beeinflusst. Zudem ist das Ausmaß der Laktaseinhibition vernachlässigbar und scheint die normale Laktoseverdauung nicht deutlich zu beeinträchtigen.

Bezüglich der Langzeiteffekte konnten wir zeigen, dass NB-DNJ die N-Glykosylierung der Disaccharidasen im ER beeinträchtigt. Dies führt zu einem verzögerten Transport und einer verzögerten Reifung von LPH und in geringerem Ausmaß auch von SI. Die durch NB-DNJ hervorgerufenen Variationen im Glykosylierungsmuster haben einen direkten Einfluss auf die Faltung dieser Proteine und folglich auf deren enzymatische Aktivitäten.

Des Weiteren inhibiert NB-DNJ die Synthese von Glycosphingolipiden, einem Hauptbestandteil von speziellen Lipid Rafts genannten Membranmikrodomänen, und führt so zu einer reduzierten Assoziierung von SI mit Lipid Rafts. Dieser Effekt könnte die generelle Funktion von SI in der Verdauung von Kohlenhydraten beeinflussen, da die Assoziierung von SI mit Lipid Rafts einerseits die Aktivität der SI erhöht und weiterhin für den korrekten Transport von SI an die Zelloberfläche benötigt wird. Dementsprechend besitzen in Gegenwart von ND-DNJ de novo synthetisiertes SI und LPH eine reduzierte funktionelle Effizienz, aufgrund einer veränderten posttranslationalen Prozessierung der Proteine. Trotzdem bleibt bei physiologischer Konzentration von NB-DNJ (≤ 50 µM) ein Hauptanteil der enzymatischen Aktivitäten dieser Disaccharidasen erhalten. Dies lässt darauf schließen, dass die beobachtete Kohlenhydratmaldigestion hauptsächlich auf die direkte Hemmung der Disaccharidasen des intestinalen Lumens durch NB-DNJ als unmittelbare Nebenwirkung zurückzuführen ist.

In einige Patienten können die unmittelbaren Effekte und die Langzeiteffekte von NB-DNJ von bereits existierenden Abnormalitäten des intestinalen Gewebes begleitet werden. Diese können die Kohlenhydratverdauung parallel beeinflussen und so die Ausprägung der intestinalen Symptome amplifizieren. Angeborene metabolische Defizienzen, welche mit einem veränderten zellulären Transport der Disaccharidasen assoziiert sind, sowie Gendefekte, welche mit einer Reduktion oder einem Verlust der enzymatischen Aktivität der Disaccharidasen einhergehen sind Beispiele dieser intestinalen Abnormalitäten.

Eine Untersuchung des genetischen Status der beiden Disaccharidasen SI und LPH vor der Behandlung von Patienten mit NB-DNJ ist anzuraten. In jedem Falle können spezielle Vorsorgen getroffen werden, wie die Behandlung mit SI und LPH Substituenten, zum Beispiel Sucraid und Präparaten der bakteriellen β-Galactosidase. Zudem können die Ernährungsgewohnheiten verändert werden. Eine Diät mit geringen Kohlenhydratanteilen sowie das Einhalten längerer Zeitintervalle zwischen der Einnahme von NB-DNJ und kohlenhydrathaltiger Kost sind zu empfehlen.

 

abstract (englisch)

N-butyl deoxynojirimycin (NB-DNJ or Miglustat) is an oral medication for treatment of lysosomal storage diseases such as Gaucher disease type I and Niemann Pick disease type C. Gastrointestinal intolerances including diarrhea, flatulence and nausea are the most common adverse effects of NB-DNJ. These symptoms are proposed to be a consequence of suppressing the intestinal carbohydrate digestion by NB-DNJ. In similar conditions to disaccharidase deficiency disorders, the maldigested/unabsorbed carbohydrates raise osmotic influx of water and electrolytes into the intestine, and are later subjected to bacterial fermentation in the colon in association with production of irritative substances.

In the current project, we have investigated the role of NB-DNJ in appearance of the gastrointestinal intolerances via two approaches:

1) Elucidation of the immediate effects of NB-DNJ on the enzymatic function of intestinal disaccharidases including sucrase-isomaltase (SI), lactase-phlorizin hydrolase (LPH) and maltase-glucoamylase (MGA).

2) Assessment of the persisting long term effects of NB-DNJ on the intestinal enzymatic function that could be elicited by alterations in the folding, intracellular processing, trafficking and targeting of the disaccharidases due to NB-DNJ.

As an immediate effect, we identified that NB-DNJ can cause carbohydrate maldigestion in the intestinal lumen particularly via inhibition of the α-glucosidic activity of the intestinal disaccharidases like SI and MGA. The observed inhibition is a combination of competitive and uncompetitive forms. Lactase as a β-galactosidase is only partly affected at high non-physiological NB-DNJ concentrations, but the extent of inhibition is negligible and does not seem to remarkably diminish normal lactose digestion at this level.

Regarding the long term consequences, NB-DNJ was found to interfere with the N-glycosylation of the disaccharidases in the ER, which leads to a delayed trafficking and maturation of LPH and to a lesser extent also SI. The variations in the glycosylation pattern because of NB-DNJ have direct effects on the folding of these proteins and subsequently on their enzymatic activities.

NB-DNJ also inhibits the synthesis of glycosphingolipids, a major component of lipid rafts, which in turn results to reduced association of SI with these membrane microdomains. This effect can eventually affects an overall digestive function of SI, since on one hand the lipid rafts are important for increasing the SI activity and secondly, they are important for the correct targeting of SI to the cell surface. Thus, the de novo synthesized SI and LPH in the presence of NB-DNJ presented reduced functional efficiencies according to altered posttranslational processing of these proteins. However, at physiological concentrations of NB-DNJ (≤50 µM) a major part of the activity of these disaccharidases is found to be still preserved, which attributes the observed carbohydrate maldigestion mostly on the direct inhibition of disaccharidases in the intestinal lumen by NB-DNJ as the immediate side effect.

In some patients, the immediate- and long term consequences of NB-DNJ might be concerted with pre-existing abnormalities in the intestinal tissue that affect the carbohydrate digestion capacity in the intestinal lumen in parallel, and thus result to an amplified occurrence of the intestinal manifestations. Inborn metabolic deficiencies associated with altered cellular trafficking of the disaccharidases as well as genetic defects that result to decreased or loss of activity of these disaccharidases are examples of these intestinal abnormalities.

It is advisable that treatment of patients with NB-DNJ should be preceded by an assessment of the genetic status of major disaccharidases such as SI and LPH. In either case particular precautions can be taken, including treatment with SI or LPH substitutes, such as sucraid or bacterial ß-galactosidase preparation, and also by changing the dietary habits to low carbohydrate diets and including proper intervals between the drug uptakes and carbohydrate consumption.

 

keywords

N-butyl deoxynojirimycin, Disaccharidasen, Magen-Darm-Beschwerden, intestinal disaccharidases, gastrointestinal intolerance 

kb

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