Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Kamila Ambroziak-Podrygajło

 

Methods of investigating drug-induced increase in the expression of the drug efflux transporter
P-glycoprotein in different cell types

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-97938

title (ger.)

Methoden zur Untersuchung der Arzneimittel-induzierten Erhöhung der Expression von P-glycoprotein, einem Medikamenten-Efflux-Transporterprotein, in verschiedenen Zelltypen

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2009

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ambroziak-podrygajlok_ws09.pdf

abstract (deutsch)

Epilepsie ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen und betrifft Menschen und Tiere, wie zum Beispiel Hunde und Katzen. Die medikamentöse Behandlung ist die am häufigsten gewählte Therapieform. Allerdings reagieren ungefähr ein Drittel der Patienten nicht in ausreichendem Maße auf die verschiedenen, eingesetzten Antiepileptika. Die Mechanismen für diese Pharmakoresistenz sind weit gehend unbekannt. Es gibt aber zwei Hypothesen, welche die Gründe für Pharmakoresistenz zu erklären versuchen: die so genannte Transporter-Hypothese und die Target-Hypothese (Schmidt und Löscher, 2009).

Entsprechend der ersten verringern Multidrug-Transporterproteine in der Blut-Hirn-Schranke die Aufnahme von Substanzen in das Gehirngewebe und führen so zu einer geringen Substanzkonzentration, die keine ausreichende Wirkung ermöglicht. Tishler et al. (Tishler et al., 1995) erbrachten Hinweise für eine Verbindung zwischen der Überexpression von Multidrug-Transportern und Pharmakoresistenz, indem sie im epileptischen Hirngewebe eine Hochregulation von P-Glycoprotein (Pgp) zeigten, eines der am besten untersuchten Multidrug-Transporterproteine.

Die Target-Hypothese handelt von strukturellen und/oder funktionellen Veränderungen an den Zielstrukturen der Antiepileptika im epileptischen Gewebe. Diese veränderten Zielstrukturen bewirken dann einen verminderten Effekt der Substanzen (Löscher und Potschka, 2005a). Beispielsweise haben Studien gezeigt, dass strukturelle und funktionelle Veränderungen der inhibitorischen GABA(A) Rezeptoren an der Resistenz gegenüber Substanzen zur Epilepsiebehandlung beteiligt sein können (Bethmann et al., 2008).

Die hier beschriebene Arbeit konzentrierte sich auf die Transporter-Hypothese, und besonders auf Pgp, als ein möglicher Hauptgrund für Pharmakoresistenz bei Epilepsie.

Um die Pharmakoresistenz zu überwinden, ist es notwendig die Mechanismen aufzuklären, die ihr zugrunde liegen. Daher wurde in dieser Arbeit untersucht, ob häufig eingesetzte Antiepileptika eine Überexpression von Multidrug-Transportern hervorrufen und so eine verringerte Substanzkonzentration im Gehirn bewirken.

Zu diesem Zweck wurden zwei Zelllinien verwendet: MDCK, eine epitheliale Nierenzelllinie, und GPNT, eine Endothelzelllinie aus dem Gehirn der Ratte. Diese Zellen wurden vor allem deswegen benutzt, weil sie als Modell für die Blut-Hirn-Schranke gelten. MDCK Zellen haben den Vorteil, dass sie bereits in Untersuchungen zum Substanztransport eingesetzt wurden, GPNT Zellen dagegen exprimieren einige endotheliale Markerproteine. Für beide Zelllinien sind die Kulturbedingungen bereits bekannt.

Zunächst mussten die Protokolle für die verwendeten Methoden zur Untersuchung von Proteinexpression und –funktion, Western Blot und Uptake Assay, etabliert werden. Die Zellen wurden mit Antiepileptika über bestimmte Zeit behandelt und anschließend wurden Expression und Funktionalität untersucht. In MDCK Zellen wurde Pgp durch den spezifischen Antikörper als doppelte Banden nachgewiesen mit Signalen bei Molekulargewichten von 140 und 160 kDa. Es lässt sich vermuten, dass beide Signale Pgp darstellen, allerdings in unterschiedlich glykosylierter Form. Es konnte gezeigt werden, dass die Bande bei 140 kDa das kern-glykosylierte Pgp darstellt, während die bei 160 kDa das voll-glykosylierte, reife Protein repräsentiert. Da in der vorliegenden Arbeit die funktionstüchtige Form von Pgp untersucht werden sollte, wurde für die Auswertungen die Bande bei 160 kDa herangezogen. Im Gegensatz zu MDCK konnte bei GPNT Zellen nur eine Bande bei 160 kDa nachgewiesen werden.

Die einzelnen Experimente mit MDCK und GPNT Zellen variierten in den Ergebnissen. Diese Beobachtung könnte in den Besonderheiten der beiden Zelllinien begründet sein. Zum Beispiel kommt es zu Veränderungen in der Pgp-Expression während der Kultivierung. Die Expression scheint dabei von der Anzahl der Passagen der jeweiligen Zellen abzuhängen. Darüber hinaus dürften Dauer und Beginn der Behandlung mit Antiepileptika im Hinblick auf die Differenzierung der Zellen von Relevanz sein.

Im Allgemeinen ergab sich durch Behandlung von MDCK Zellen mit Antiepileptika keine Beeinflussung der Pgp-Expression. Auch in GPNT Zellen wurden Expression und Funktion unter Behandlung nicht verändert. Hier konnte allerdings funktionelles Pgp nachgewiesen werden. So zeigte sich im Uptake Assay nach Zugabe des Pgp-Inhibitors Tariquidar eine signifikant erhöhte Aufnahme von Pgp-Substraten in die GPNT Zellen. Nach Behandlung mit Antiepileptika dagegen wurde keine veränderte Pgp-Funktion im Transport von zwei Pgp-Substraten, Digoxin und Vinblastin, beobachtet.

Insgesamt konnten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit keine robusten Effekte auf Pgp-Expression und -Funktion nach Behandlung mit Antiepileptika zeigen. Allerdings könnte es sein, dass sich die hier gewählten Zelllinien, GPNT und MDCK, nicht als Modelle für diese Untersuchungen eignen, entweder aufgrund eines hohen endogenen Pgp-Spiegels oder wegen hoher Expression anderer Multidrug-Transporter.

Daher wären weitere Experimente mit anderen Zelllinien notwendig, um die Transporter-Hypothese noch besser zu untersuchen und möglicherweise geeignetere Modelle für Pgp-Expressionstudien  zu finden.

 

abstract (englisch)

Epilepsy is one of the most common neurological disorders, which affects humans and animals, like dogs and cats. Drug treatment is still the most often used therapy. However, about one third of epileptic patients do not respond to distinct AEDs. The mechanisms of pharmacoresistance are poorly understood. Nonetheless, there are two major hypothesis explaining pharmacoresistance, multidrug hypothesis and drug target hypothesis (Schmidt and Löscher, 2009).

According to the first hypothesis, overexpression of multidrug transporters in blood-brain barrier decreases drug uptake in the brain, which lead to insufficient drug concentration needed for effective treatment. An evidence for correlation between overexpression of multidrug transporter and pharmacoresistance came from work by Tishler et al. (Tishler et al., 1995). Group showed upregulation, one of the most examined multidrug transporters, Pgp in epileptic brain tissue.

Drug target hypothesis, suggests that alterations in the structure and/or functionality of AED targets in epileptogenic brain regions lead to reduced drug effects (Löscher and Potschka, 2005a). For instance, experimental studies have shown that changes in the structure and function of inhibitory GABA(A) receptors may contribute to drug resistance in epilepsy (Bethmann et al., 2008).

Presented thesis was concentrated on multidrug transporter hypothesis, especially on
Pgp, as a main
principal for pharmacoresistance in epilepsy.

In order to overcome the pharmacoresistance in epilepsy, it is relevant to explore the mechanisms that lead to refractory epilepsy. Thus, presented thesis was meant to investigate whether commonly used AEDs might cause overexpression of multidrug transporters resulting in decrease drugs concentration in the brain.

For purpose of thesis two cell lines were tested: MDCK epithelial kidney cells and GPNT rat brain endothelial cells. The reason for using those cells was mostly that they are recognized as a model of blood-brain barrier. Further, MDCK cells were used in study on drug transport, GPNT express several endothelial markers and for both cell lines cultering conditions were established.

Study in cell lines began from establishing of protocols for Western blotting and uptake assay methods, which are used to investigate expression and functionality of proteins. Cells were treated with antiepileptic drugs for certain period of the time, and then protein expression and functionality were analyzed. Pgp protein in MDCK cells was recognized by anti-Pgp antibody as double bands with molecular weights of approximately 140 kDa and 160 kDa. Both bands seemed to be Pgp proteins that differed in glycosylation. As it was shown, Pgp with molecular weight around 140 kDa is core-glycosylated form of Pgp, the signal around 160 kDa in turn seems to be fully glycosylated, mature form of Pgp. In presented thesis, mature form of Pgp was investigated. Thus, for quantification of the Pgp expression, bands around 160 kDa were taken as signals representing mature proteins. In contrast to MDCK, in GPNT cells anti-Pgp antibody has recognized only single band with molecular weight around 160 kDa.

Individual experiments in MDCK and GPNT cells differed in results. The observed variance could be due to particular characteristics of the used cell lines, for instance changes in Pgp expression during the culturing that could depend on passage of the cells. Furthermore, period and beginning of the treatment (differentiation of the cells) might be relevant.

In general, treatment with AEDs did not influence Pgp expression in MDCK cells. In GPNT cells, Pgp expression and functionality were not affected as well. However, Pgp was functionally active in GPNT cells, which was improved by significant increase in uptake of Pgp substrates after exposure to Pgp inhibitor tariquidar. No effect on Pgp fuctionality after exposure to AEDs was observed in uptake assays with both Pgp substrates: digoxin and vinblastine.

Thus, the results of presented thesis did not indicate any robust effect on Pgp expression and functionality after AEDs treatment. However, GPNT and MDCK cells might be not ideal models for studying drug-induced alterations in Pgp expression, because of high level of endogenous Pgp and other multidrug transporters.

More research must be done to verify multidrug transporter hypothesis and find suitable models for
Pgp expression investigation.

 

keywords

Pgp, Epilepsie, Pharmakoresistenz, Pgp, epilepsy, pharmacoresistance

kb

2.809