Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Dana Alms

 

Untersuchungen zur Induktion von Efflux-Transportern („Multidrug-Transportern“) durch Antiepileptika und bekannte Induktoren und deren Transport in Hirnkapillarendothelien der Bluthirnschranke verschiedener Spezies

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-102682

title (engl.)

Induction of multidrug transporters by antiepileptic drugs and known inducers and their transport in brain capillary endothelial cells of the blood-brain barrier of different species

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/almsd_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Epilepsien betreffen Schätzungen zufolge etwa 50 Millionen Menschen (DUNCAN et al. 2006), weshalb eine wirksame Behandlung von großem Interesse ist. Die Patienten werden vorrangig mit Antiepileptika therapiert. Diese Medikamente zeigen aber bei etwa einem Drittel der Patienten nur eine unzureichende oder gar keine Wirkung (KWAN & BRODIE 2000). Es ist bis heute unklar, wodurch das Phänomen der Pharmakoresistenz ausgelöst wird. Ein viel diskutierter Ansatz ist die Multidrug-Transporter-Hypothese. Dieser zufolge führt eine Überexpression sogenannter Multidrug-Transporter (MDT) an der Bluthirnschranke (BHS) zu einem vermehrten Efflux der Antiepileptika zurück ins Blut, weshalb nur unzureichende Konzentrationen im epileptischen Fokus erreicht werden. Erste Zusammenhänge zwischen einer Hochregulierung solcher Transporter und der Pharmakoresistenz zeigten die Studien von TISHLER et al. (1995), die den gut untersuchten Transporter P-Glykoprotein (Pgp) in epileptischem Hirngewebe nachwiesen. Des Weiteren erbrachten Studien den Nachweis, dass Pgp eine Reihe der therapeutisch eingesetzten Antiepileptika transportiert (LUNA-TORTÓS et al. 2008 & 2009), wodurch niedrige Konzentrationen im Gehirn ebenfalls zu erklären sind. Dieser Transport wurde bisher nur für Phenytoin in Kapillarendothelzellen humanen Ursprungs untersucht (CUCULLO et al. 2007), weshalb in der vorliegenden Arbeit die immortalisierte humane Zelllinie hCMEC/D3 als In-vitro-Modell eingesetzt wurde. Mit dieser Zelllinie sollte geklärt werden, ob der Transport von Antiepileptika durch Pgp nachgewiesen werden kann. Immortalisierte Endothelzellen gelten allerdings aufgrund einer unzureichenden Integrität der Zellmonolayer als ungeeignet für Transportstudien (DELI et al. 2005; ROUX & COURAUD 2005). Aus diesem Grund wurden zusätzlich Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der Ratte präpariert. Diese wurden im Transwell-Modell eingesetzt, um deren Eignung und Pgp-spezifischen Transport untersuchen zu können.

Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der MDT-Hypothese, der damit verbundenen Überexpression der MDT sowie der Etablierung einer humanen Zelllinie als Transwell-Modell. Von besonderem Interesse war dabei das Pgp. Es ist nicht hinreichend geklärt, wodurch eine verstärkte Funktion dieser Transporter bei epileptischen Patienten ausgelöst wird. Ziel der Untersuchungen war es herauszufinden, ob Antiepileptika die Funktionalität von Pgp induzieren. Dazu wurde die humane Zelllinie hCMEC/D3 ausgewählt. Bei hCMEC/D3-Zellen handelt es sich um immortalisierte Endothelzellen aus dem Temporallappen einer pharmakoresistenten Epilepsiepatientin (WEKSLER et al. 2005). Die hCMEC/D3-Zellen exprimieren für Endothelien typische Marker-proteine und werden für In-vitro-Untersuchungen eingesetzt (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). In vorläufigen Studien wurden auch primäre Hirnkapillarendothelzellen der Ratte eingesetzt.

Der Western Blot ermöglichte den Nachweis von Pgp sowohl in den immortalisierten hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen als auch in den primären Hirnendothelien der Ratte. Die funktionelle Untersuchung wurde mit Hilfe von Kumulations-Assays mit dem Pgp-Substrat Rhodamin 123 durchgeführt. Dazu wurden hCMEC/D3-, GPNT- und RBE4-Zellen mit den Antiepileptika Carbamazepin, Levetiracetam, Phenobarbital, Phenytoin, Topiramat und Valproat behandelt. In den Primärkulturen wurden Carbamazepin und Phenytoin untersucht. Die Behandlung erstreckte sich i.d.R. über drei Tage. Im Kumulations-Assay konnte für alle Zelllinien und den primären rBCEC-Zellen funktionelles Pgp nachgewiesen werden, dessen Funktion durch bekannte Induktoren und den spezifischen Inhibitor Tariquidar moduliert werden konnte. Dabei zeigten die hCMEC/D3-Zellen funktionelles Pgp, welches sich trotz vergleichsweise geringer Expression nur schwer induzieren ließ. Die Ergebnisse der Kumulations-Assays variierten in den Zellen der verschiedenen Spezies. Die Funktionalität von Pgp wurde nicht von allen Antiepileptika in den gewählten Konzentrationen beeinflusst. Das heißt, dass die getesteten Antiepileptika nicht in allen Zellen induzierende Wirkungen hatten. Die robustesten Effekte in hCMEC/D3-Zellen ließen sich mit Carbamazepin (100 µM) und Valproat (300 µM) zeigen. In RBE4-Zellen induzierte Carbamazepin (50 µM) die Funktionalität Pgps. In den Versuchen mit rBCEC-Zellen führten Carbamazepin und Phenytoin zu einer Inhibition der Pgp-Funktionalität. In GPNT-Zellen wurden trotz der Induktion durch bekannte Induktoren keine induzierenden Effekte nach der Behandlung mit Antiepileptika beobachtet. Aufgrund dieser variablen Ergebnisse sollten weitere Konzentrationen der Antiepileptika untersucht werden, um mögliche konzentrationsabhängige Effekte nachweisen zu können. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen aber einen Einfluss von Antiepileptika auf die Funktion des MDT Pgp vermuten. Die Frage, welche Antiepileptika zu einer Modulation der MDT führen, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abschließend beantwortet werden.

Bezüglich der Transportuntersuchungen ist zu sagen, dass die Ergebnisse sehr variabel waren. Aufgrund vieler verschiedener Protokolle zur Präparation und Kultivierung für Primärkulturen wurde dies bereits für primäre Zellen beschrieben (CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). Nach der Anpassung mehrerer Parameter, v.a. für hCMEC/D3-Zellen, konnte ein asymmetrischer Transport des Pgp-Substrats Rhodamin 123 in diesen Zellen und rBCEC-Zellen nachgewiesen werden. Die Kokultivierung mit Astrozyten trug zu einer Verbesserung des Transwell-Modells bei, die sich in höheren TEER-Werten und leicht reduzierten Mannitol-Permeabilitäten zeigte. Demzufolge führte die Kokultur dieser Gliazellen mit den Hirnkapillarendothelien aus Mensch und Ratte zu einer Erhöhung der Integrität der Monolayer. Der asymmetrische Transport von Rhodamin 123 konnte aber nur teilweise durch Tariquidar und Valspodar inhibiert werden. Zusätzlich machen die relativ niedrigen TEER-Werte und die hohen Mannitol-Permeabilitäten deutlich, dass die optimalen Bedingungen noch nicht gefunden wurden. Die Optimierung der immortalisierten hCMEC/D3-Zellen und Primärkulturen des Hirnkapillarendothels der Ratte sowie auch weiterer Spezies als Transwell-Modell bzw. die Etablierung des humanen dynamischen In-vitro-BHS-Modells (STANNESS et al. 1996; CUCULLO et al. 2002) könnten dazu beitragen, gezielte In-vitro-Untersuchung des Transports von Antiepileptika durch MDT an der BHS durchzuführen.

 

abstract (englisch)

Approximately 50 million peoples are affected by epilepsies (DUNCAN et al. 2006) and efficient therapies are of great interest. In most cases patients are treated with antiepileptic drugs (AEDs). But one third of the epileptic patients is not seizure-free under the AED treatment (KWAN & BRODIE 2000). Reasons for the phenomenon of pharmacoresistance are until now not fully understood. According to the multidrug transporter hypothesis, one explanation for pharmacoresistance, an overexpression of multidrug-resistance transporters (MDTs) at the blood-brain barrier (BBB) leads to an increased efflux of AEDs back to the blood and consequently inadequate concentrations in the epileptic focus. TISHLER et al. (1995) first described correlations between overexpression of multidrug-resistance transporter proteins and pharmacoresistance by detection of the well investigated MDT P-glycoprotein (Pgp) in epileptic tissue. Furthermore, studies provided evidence that several AEDs are transported by Pgp in therapeutic concentrations (LUNA-TORTÓS et al. 2008 und 2009). This would explain low brain concentration of these substances. So far, only the antiepileptic drug phenytoin was investigated regarding the transport by Pgp in human brain capillary endothelial cells (CUCULLO et al. 2007).

One object of the thesis was the investigation of the immortalized human brain endothelial cell line hCMEC/D3 as an in vitro model of the BBB and the transport of AEDs by Pgp in cells of human origin. But because of an insufficient tightness of the cell monolayers, immortalized brain endothelial cells are considered to be not suitable for transport studies (DELI et al. 2005; ROUX & COURAUD 2005). Therefore, primary rat brain endothelial cells were dissected and utilized for transport assays to detect Pgp-specific transport.

The thesis dealt with the MDT hypothesis, the associated overexpression of MDTs and the establishment of a human cell line in a transwell model. The initial cause of increased functionality of MDTs especially Pgp in epileptic patients is not adequately defined. One aim was to investigate, if AEDs induce Pgp functionality. For this purpose the immortalized human cell line hCMEC/D3, which was derived from the temporal lobe of a pharmacoresistant epilepsy patient (WEKSLER et al. 2005), was chosen. These cells express characteristic endothelial marker proteins and are used for in vitro studies (WEKSLER et al. 2005; POLLER et al. 2008; CARL et al. 2010). In preliminary studies, primary rat brain endothelial cells (rBCEC) were also used in a transwell model.

Expression of Pgp was detected by Western blot in all immortalized cell lines (hCMEC/D3, GPNT, RBE4) and in the primary rBCEC cells. Functional analysis was performed by accumulation assays (or uptake assays) with the Pgp substrate rhodamine 123. Therefore, hCMEC/D3, GPNT, and RBE4 cells were exposed to the widely used AEDs carbamazepine, levetiracetam, phenobarbital, phenytoin, topiramate, and valproate at different therapeutic concentrations. For rBCEC cells, carbamazepine and phenytoin were investigated. Typically, the cells were treated for three days. In the uptake experiments functional Pgp in the cell lines hCMEC/D3, GPNT, and RBE4 as well as in rBCEC cells was detected, which could be modulated by known Pgp inducers and the known Pgp inhibitor tariquidar. The hCMEC/D3 cells showed only little inducing effects for Pgp-mediated efflux although the expression of this protein was relatively low compared to other cell lines. Data of the accumulation assays varied widely in cells of the different species. Pgp functionality was not affected by all tested AEDs in the chosen concentrations. In hCMEC/D3 cells, robust effects were detected after the treatment with carbamazepine (100 µM) and valproate (300 µM). In RBE4 cells, carbamazepine and topiramate induced Pgp functionality. In experiments with rBCEC cells carbamazepine and phenytoin led to an decreased efflux of the Pgp substrate rhodamine 123 and therefore the used concentrations of these AEDs seemed to have inhibiting effects on the Pgp functionality. Although known Pgp inducers in GPNT cells induced the rhodamine efflux, no effects were detected after treatment with AEDs. Because of varying results the analysis of additional concentrations of the AEDs is important to detect possible concentration-dependent effects. Data of the rhodamine uptake assays lead to the conclusion that several AEDs affect the functionality of Pgp.

The transport studies revealed variable data. For primary brain cultures similar variable results were already described due to many different preparation and cultivation protocols (CALABRIA et al. 2006; ZHANG et al. 2006). After modification of different parameters, especially for hCMEC/D3 cells, asymmetric transport of rhodamine 123 in these cells and rBCEC cells was detectable. Co-cultivation with astrocytes improved the transwell model by higher TEER values and slightly reduced mannitol permeabilities. Accordingly the co-culture of the immortalized human and primary rat brain endothelial cells with these glial cells led to an increased integrity of the monolayers. But the asymmetric transport of rhodamine 123 could only partially be inhibited by tariquidar and valspodar. Moreover, in comparison with literature the relatively low TEER values and the high permeabilities of mannitol revealed that the ideal conditions are not yet found. However, the improvement of the immortalized human hCMEC/D3 cells and the primary brain endothelial cells of rats as well as of other species as transwell model and the establishment of the humanized dynamic in vitro BBB model (STANNESS et al. 1996; CUCULO et al. 2002) respectively may contribute to specific investigations of AEDs transport by MDTs at the BBB.

 

keywords

P-Glykoprotein, Antiepileptika, Bluthirnschranken-Modell, P-glycoprotein, antiepileptic drugs, blood-brain barrier mod

kb

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