Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Tamiru Negash Alkie

 

Molecular epidemiology of infectious bursal disease viruses and development of a microparticle based vaccine

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-102670

title (ger.)

Molekulare Epidemiologie Infektiöser Bursitis Viren und Entwicklung einer Mikropartikel-basierten Vakzine

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2013

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/alkiet_ss13.pdf

abstract (deutsch)

Das Infektiöse Bursitis Virus (IBDV) ist ein immunsuppressives Virus, welches Hühner infiziert und eine Verbreitung über alle Kontinente aufweist. IBDV löst vorwiegend in der Bursa Fabricii aber auch in anderen lymphatischen Geweben B-Zell-Depletion aus. Das Virusprotein (VP) 2 und das VP1 tragen zur Pathogenität von IBDV bei. Neutralisierende Antikörper (Abs) werden gegen das Hauptstrukturprotein VP2 gebildet.

Die vorliegende Studie hatte zum Ziel, die molekulare Epidemiologie von IBDV in Äthiopien zu untersuchen und eine neue Formulierung für eine IBDV-DNA-Vakzine, zu entwickeln, in dem diese an biologisch abbaubare Poly- (D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) Mikropartikel (MPs) adsorbiert und nach Applikation langsam freigesetzt werden kann.

IBDV-Feldisolate aus verschiedenen erkrankten äthiopischen Hühnerbeständen wurden charakterisiert. In vivo Studien zeigten, dass diese Isolate stark replizierten und signifikante Läsionen in der Bursa infizierter Hühner hervorriefen. Molekulare Charakterisierung durch RT-PCR mit nachfolgender Sequenzierung der hypervariablen Region des VP2 (hVP2) und Zweidritteln des 5´Endes des VP1 zeigten große Homologien zu hochvirulenten (vv) IBDVs. Anhand phylogenetischer Analysen der VP2-Regionen wurden alle IBDV-Isolate dem hochvirulenten Genotyp zugeordnet. Molekulargenetisch identifizierte Aminosäuren (aa), die als Virulenzmarker dienen, waren in der hVP2-Region aller Stämme hochkonserviert. Die VP1-Region wies sowohl charakterliche aa-Sequenzen von vvIBDV als auch attenuierten Stämmen auf. Weitere Studien über die Bedeutung dieser aa-Positionen zur Klärung der Virulenzmechanismen sind nötig. Obwohl die Herden mit klassischen Lebendvakzinen gegen IBDV geimpft waren, weisen die Ergebnisse dieser molekularepidemiologischen Studie auf die Bedeutung von vvIBDV als Ursache der großen wirtschaftlichen Verluste in den verschiedenen Geflügel-Produktionsebenen Äthiopiens hin. Daraus ergeben sich Fragen, wie durch neue Impfstrategien bzw. durch die Auswahl eines geeigneten Impfstammes ein Impfversagen zukünftig vermieden werden kann.

Die Möglichkeit der Reversion von IBDV-Lebendvakzinen im Feld zu Stämmen höherer Virulenz, erfordert die Entwicklung einer neuen Generation von IBDV-Impfstoffen. Es wurden zwei Plasmid basierte IBDV-DNA-Vakzinen hergestellt, die die VP2 Gene von zwei verschiedenen vvIBDVs kodierten. Die Immunogenität, sowie der hervorgerufene Impf-Schutz wurden evaluiert. Eine signifikante Anzahl an spezifisch-pathogenfreien Hühnern, die intramuskulär mit den IBDV-DNA-Vakzinen geimpft worden waren, serokonvertierten und waren partiell gegen eine orale Belastungsinfektion mit vvIBDV-Stämmen geschützt. Hühner, die mit der DNA-Vakzine geimpft wurden, entwickelten weniger Bursaläsionen im Vergleich zu nicht geimpften Tieren. Die gleichzeitige Gabe der DNA-Vakzine mit plasmidkodiertem Hühner IL-2 (chIL-2) oder CpG-ODN führte weder zu einer besseren Serokonversion noch zu einem besseren Schutz. Nachfolgend wurde die Applikation der DNA-Vakzine durch die Adsorption des Impfstoffes und molekularer Adjuvantien an PLGA basierte MPs modifiziert.

Die orale und intranasale Schleimhautapplikation der VP2-DNA beladenen MP (VP2-MP) wurde kombiniert mit einer verzögerten Applikation von mit chIL-2 oder CpG-ODN beladenen MPs. Hühner, die mit dem VP2-MP geimpft worden waren, waren unabhängig vom Einsatz von Adjuvantien signifikant besser gegen eine orale Belastungsinfektion geschützt als Hühner, die mit unbeladenen MPs, MPs mit Adjuvanz oder Vektor inokuliert worden waren. VP2-MP geimpfte Hühner zeigten ein besseres Bursa-Körpergewichtsverhältnis (B/B), einen geringeren Bursaläsions-score, weniger IBDV-Antigen und eine geringere Anzahl an T-Zellen in der Bursa im Vergleich zu ungeschützten Tieren. Eine schnelle Virus Elimination führte nach der Belastungsinfektion insbesondere bei den zusätzlich mit chIL-2-MP inokulierten Tieren zu niedrigeren Titern virusneutralisierender Antikörper, sowie zu einer geringeren Expression von IL-4 und IFN-α mRNA in der Bursa. Das vorgestellte Impfkonzept stellt eine wichtige Grundlage für weitere Entwicklungen und Optimierungen der IBDV-DNA Impfung dar und bietet eine mögliche Alternative zum Schutz von Hühnern gegen IBDV.

 

abstract (englisch)

Infectious bursal disease virus (IBDV) is an immunosuppressive virus of chickens with distribution across all continents. IBDV results in B-cell depletion primarily in the bursa of Fabricius, but other lymphoid tissues may be affected. Virus proteins (VP) 2 and VP1 contribute to the pathogenicity of IBDV, whereby VP2 as the main structural protein elicits neutralizing antibodies (Abs).

The present study was designed to understand the molecular epidemiology of IBDV in Ethiopia and to develop a new generation IBDV DNA vaccine in combination with a slow release vaccine delivery system on the basis of biodegradable poly(D, L-lactide-co-glycolide) (PLGA) microparticles (MPs).

We characterized IBDV field isolates from different Ethiopian chicken flocks showing clinical IBD. In vivo experimental studies demonstrated that these isolates replicated extensively and induced significant bursal lesions in chickens. Molecular characterization by RT-PCR and sequencing of the hypervariable region of VP2 (hVP2) and the 5’ two-thirds of VP1 revealed close homology to very virulent (vv) IBDVs. Phylogenetic analysis of the VP2 region showed that all IBDV isolates had a vv genotype. Molecularly identified virulence marker amino acids (aa) at the hVP2 region have been well conserved in these strains. The VP1 region encoded aa residues typical for vvIBDV but also for attenuated IBDV strains. The implication on virulence mechanism needs further investigation. This molecular epidemiological study revealed vvIBDV as the major cause of severe losses in the different segments of poultry production in Ethiopia despite vigorous vaccination with classical live IBDV vaccines. Questions regarding vaccination failure need to be addressed in the future including appraisal of the vaccination strategy itself and the selection of vaccine strains.

Reversion of live IBDV vaccines to more virulent strains in the field justifies the development of new generation IBDV vaccines. In this study plasmid based IBDV-DNA vaccines were developed encoding the VP2 gene of two different vvIBDV strains. Their immunogenicity and the consequent protection were evaluated. Significant numbers of specific pathogen free (SPF) chickens intramuscularly vaccinated with IBDV-DNA vaccines did seroconvert, and were partially protected against oral challenge with vvIBDV. DNA vaccinated chickens developed less severe bursal lesions compared to non-vaccinated ones. Co-administration of plasmid encoded chicken IL-2 (chIL-2) or CpG-ODN and the VP2-DNA vaccine neither enhanced seroconversion nor protection. Subsequently the DNA vaccine application was modified by adsorption of vaccine and molecular adjuvants onto PLGA based MPs.

We investigated mucosal (oral and intranasal) application of the VP2-DNA loaded MP (VP2-MP) in combination with a delayed mucosal delivery of MP loaded either with chIL-2 or CpG-ODN. Chickens inoculated with the VP2-MP with or without adjuvants were significantly better protected against oral challenge compared to chickens inoculated with unloaded-MPs or with MPs loaded with adjuvants or vector only. VP2-MP-vaccinated chickens showed  higher bursal to body weight (B/B) ratio, lower bursal lesion scores, reduced IBDV antigen load and less T-cell influx into the bursae compared to the different control groups. Rapid virus clearance particularly in the group inoculated additionally with chIL-2 loaded MPs lead to lower postchallenge virus neutralizing Ab titers, and lower IL-4 and IFN-a mRNA expression levels in the bursa. The results of this vaccination study provide proof-of-concept for further development and optimization of this vaccination platform as a possible alternative strategy to protect chickens against IBDV.

 

keywords

Infektiöse Bursitis Virus, Vakzine, Geflügel, Infectious bursal disease virus, Vaccine, poultry

kb

576