Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

Nussieba Ahmed Osman Elhag

Expression studies of peste des petits ruminants virus (PPRV)

haemagglutinin and fusion envelope glycoproteins

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-106156

title (ger.)

“Studien zur Expression die Hüllproteine Hämagglutinin und Fusionsprotein des Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (peste des petits ruminants virus, PPRV)”

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2015

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ahmedosmanelhagn_ss15.pdf

abstract (deutsch)

Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR) ist eine hoch infektiöse und sich gegenwärtig stark ausbreitende virale Erkrankung der kleinen Haus- und Wildwiederkäuer. Es ist eine der meldepflichtigen Krankheiten des Internationalen Tierseuchenamts (OIE). Aufgrund seiner sehr hohen Morbidität und Mortalität hat diese Tierseuche dramatische wirtschaftliche Auswirkungen auf die landwirtschaftliche Haltung kleiner Wiederkäuer in Entwicklungsländern, in denen sie endemisch ist. PPR wird verursacht durch das Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (PPRV), einem Mitglied der Gattung Morbillivirus in der Unterfamilie Paramyxovirinae der Familie Paramyxoviridae in der Ordnung Mononegavirales. PPRV hat zwei Oberflächenglykoproteine: das Hämagglutinin (H) und das Fusionsprotein (F), die in der viralen Hülle als Spikes erscheinen. Diese Oberflächenglykoproteine führen durch Anheftung über H und anschließender F-vermittelter Fusion der viralen Hülle mit der Wirtszellmembran zum Eindringen des Virus in die Zielzelle. PPRV-F vermittelnde Zell-Zell Fusion führt zur Bildung von Synzytien, ein Merkmal bei PPRV infizierten Zellkulturen, das es dem Virus ermöglicht sich direkt von Zelle zu Zelle auszubreiten. Somit sind H und F die wichtigsten Angriffspunkte für eine schützende Immunantwort in infizierten und geimpften Tieren durch neutralisierende Antikörper. Aufgrund ihrer Lage und Funktion sind H und F gute Kandidaten für die Entwicklung neuartiger diagnostischer Tests auf Basis rekombinanter Biotechnologie.

Die Sequenzierung der gesamten offenen Leserahmen (ORFs) von H und F des Impfstammes PPRV Nigeria 75/1 (Linie I) und des virulenten Feldisolates PPRV Kurdistan Stamm 2011 (Linie IV) ergab Längen von 1827 beziehungsweise 1638 Nukleotiden (nt) (ohne die jeweiligen Stopcodons), die folglich für Proteine von 609 und 546 Aminosäuren (aa) mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von 68 kDa und 60 kDa kodieren. Die Nukleotidsequenzen H- und F-ORFs des PPRV-Stammes Kurdistan 2011 wurden in die GenBank eingestellt (Zugriffsnummern KF648288.1 beziehungsweise KF648287.1). Vergleichende Aminosäuren- (aa) und Nukleotidsequenzanalysen (nt), durchgeführt mit den jeweiligen vollständigen Sequenzen mit den entsprechenden Sequenzen in Genbank ergab den höchsten Gad an Homologie mit PPRV Linie IV Stämme, vertreten durch die PPRV Turkey 2000. Phylogenetische Neighbor-joining Tree Analysen, erzeugt entweder auf der Basis der vollen Länge (1827 nt) oder teilweiser 612 nt (1174-1785 nt) Nukleotidsequenzen des H-ORF beziehungsweise der vollen Länge (1638 nt) oder der teilweise 322 nt (254-575 nt) Nukleotidsequenzen des F-ORF, ordneten  Kurdistan 2011 dem Linie  IV Genotyp zu.

Die zur Verfügung stehenden monoklonalen Antikörper (MAK) gegen F und H waren nicht geeignet, Expression und Reifung der genannten Proteine zu untersuchen, da diese weder im Immunoblots noch in der Immunpräzipitation einsetzbar waren. Daher wurden Segmente der ORFs, ausgewählt auf Grund der Hydrophobizitätsprofile ihrer kodierten Aminosäuresequenz, in-frame an den ORF für das Maltose-Bindungsprotein im Plasmid pMal-p2X fusioniert und in E.coli TB1 exprimiert. Monospezifische Seren gegen gereinigte Fusionsproteine wurden in Kaninchen hergestellt. Die jeweiligen Seren erkannten spezifisch die zugehörigen Zielproteine in indirekten Immunfluoreszenz, Immunoblots und Immunpräzipitation-Assays.

In VeroMontpellier-Zellen entstanden nach Infektion mit dem PPRV Nigeria 75/1 Impfstamm keine Synzytien. Die Analysen der Expression und der intrazellulären Reifung mit Hilfe der monospezifischen Antikörper ergaben, daß H wie erwartet exprimiert und modifiziert wurde. Im Gegensatz dazu schien die Reifung von F sehr ineffizient zu erfolgen was das Fehlen der Synzytien Bildung in infizierten VeroMontpellier Zellen erklären kann. Diese Eigenschaft könnte jedoch von Vorteil für die Virusausbeute sein da die erreichten Titer in infizierten VeroMontpellier Kulturen ca 100-fach höher sind als in Synzytien bildenden Vero/dog-SLAM Zellen.

Für die ektopische Expression von H und F wurden verschiedene Ansätze versucht, welche die Integration der gesamten oder partieller offener Leserahmen (ORFs) für H und F von PPRV Nigeria 75/1 in verschieden Vektoren umfassten.

Alle Versuche die PPRV-Oberflächenglykoproteine durch das bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) mittels einer eigenen Expressionskassette als Ganzes oder in Teilen genetisch fusioniert an die aminoterminale Untereinheit des essentielle Glycoprotein B (gB), waren erfolglos. Transiente Expressions und Komplementationsanalysen zur Klärung der Ursache(n) der Inkompatibilität der PPRV Proteinexpression mit infektiöser BHV-1 Replikation ließen darauf Schließen, daß F und H  mit dem intrazellulären Transport von gB interferieren und dadurch die Entstehung von BHV-1 Rekombinanten unmöglich.

Da sich die zur Überexpression von Proteinen häufig verwendeten immediate early Enhancer/Promotor Elemente des murinen und humanen Cytomegalovirus als nicht geeignet für eine deutliche Expression von PPRV F und H erwiesen hatten, wurde, das Expressionsplasmid pCAGGS auf Tauglichkeit geprüft. In diesem Plasmid kontrolliert ein Hybrid Enhancer/Promotor Element (Enhancer vom humanes Cytomegalovirus, Promotor vom Hühner ß-Aktin Gen) die Transkription des Ziel-ORF. Die jeweiligen ORFs der Membranglycoproteine der Stämme Nigeria 75/1 Impfstamm und Kurdistan 2011 wurden in pCAGGS integriert und deren Expression nach transienter Expression mit Hilfe der monospezifischen Seren analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß die jeweiligen Proteine in signifikanten Mengen synthetisiert und in die Zellmembranen eingelagert werden. Damit wurde die Voraussetzung geschaffen,  in zukünftigen  Arbeiten neuartige, auf der ektopischen Expression von PPRV F und H basierende, Diagnostika zu entwickeln.

abstract (englisch)

Peste des petits ruminants (PPR) is a highly contagious and infectious viral disease of domestic and wild small ruminants. It is one of the diseases notifiable to the World Organization for Animal Health (OIE). Due to its high morbidity and mortality rates the disease has an economic impact and influence on small animal industry in developing countries where it is endemic. PPR is caused by peste des petits ruminants virus (PPRV) a member of the morbillivirus genus in the Paramyxovirinae subfamily of the Paramyxoviridae family in the order Mononegavirales. PPRV has two surface glycoproteins: the haemagglutinin (H) and fusion protein (F) that appear as spikes on the viral envelope. Viral surface glycoproteins are essential for entry into the cytoplasm, a process accomplished by attachment via H and fusion of the viral envelope with the host cell membrane via F. PPRV-F mediated cell-cell fusion leads to syncytia formation, a characteristic observed in PPRV infected cell cultures, leading to virus spread from cell to cell. The interaction of H and F surface glycoproteins of PPRV with the host cell surface is accountable for initiation of viral infection process and therefore being the main target for inducing a strong protective immune response in infected and vaccinated animals represents by neutralizing antibodies. Due to their position and function, H and F surface glycoproteins of PPRV would be considered as suitable candidates for the establishment of recombinant technology based novel diagnostic assays.

Sequences of the full length open reading frames (ORFs) encoding the H and F of PPRV Nigeria 75/1 vaccine strain (lineage I) and the virulent isolate PPRV Kurdistan strain 2011 (lineage IV) revealed genes of 1827 and 1638 nucleotides (nt) in length (excluding the stop codon) which thus encode proteins of 609 and 546 amino acids (aa) with apparent molecular masses of 68 KDa and 60 KDa, respectively. Nucleotide sequences of the ORFs encoding H and F of PPRV strain Kurdistan 2011 were submitted to GenBank database (accession numbers KF648288.1 and KF648287.1, respectively). Comparative nucleotide sequence analyses performed for the entire H- and F- ORFs and amino acid sequences of Kurdistan 2011 with the respective sequences of PPRV isolates available in GenBank revealed the highest degree of homology with PPRV lineage IV strains represented by Turkey 2000. Phylogenetic neighbor-joining trees generated based on either the full length (1827 nt) or the partial 612 nt (1174-1785 nt) nucleotide sequences of the H-ORF and the full length (1638 nt) or the partial 322 nt (254-575 nt) nucleotide sequences of the F-ORF clustered Kurdistan 2011 strain in PPRV lineage IV genotype.

To overcome the failure of available H and F monoclonal antibodies (MAbs) to demonstrate expression and further maturation of the aforementioned proteins by PPRV and recombinant constructs using immunoprecipitation and immunoblotting, partial ORFs encoding H and F proteins of PPRV - selected based on their deduced hydrophobic profile - were fused in frame to the maltose binding protein (MBP) ORF of bacterial expression vector pMal-p2X and expressed in E.coli TB1 bacteria. Monospecific sera directed against both PPRV proteins were raised in rabbits against the respective purified fusion proteins. The respective sera proved to be suitable for use in indirect immunofluorescence, immunoblotting and immunoprecipitation assays.

Infection of VeroMontpellier cell cultures with PPRV Nigeria 75/1 vaccine strain did not lead to the development of syncytia. Analyses of the expression and intracellular maturation using the monospecific sera revealed that H was expressed and, as expected, modified. In contrast, maturation of F appeared to be at least inefficient which can explain the absence of syncytia in infected VeroMontpellier cell cultures. This property may, however, be of advantage for virus yield because achievable final titers were 100 fold lower in syncytia-forming Vero/dog-SLAM cells.

To achieve ectopic expression of H and F surface glycoproteins of PPRV, several approaches have been attempted to integrate the entire or partial open reading frames (ORFs) for H and F of PPRV Nigeria 75/1 vaccine strain into vectors.

All attempts to express the PPRV surface glycoproteins by recombinant bovine herpesvirus 1 (BHV-1) from entirely from an own expression cassette or of parts after genetic fusion to the amino terminal subunit of the essential glycoprotein B (gB) were without success. Transient expression and complementation experiments to clarify the cause for the incompatibility of the expression of PPRV protein expression with infectious BHV-1 replication indicated that F and H and the used domains therefore interfered with intracellular transport of gB and thus precluded generation of BHV-1 recombinants.

Since the immediate early enhancer/promoter elements, frequently used to direct overexpression of target proteins, proved to be inapplicable for sufficient expression of PPRV F and H, expression plasmid pCAGGS was tested for suitability. In this plasmid a hybrid enhancer/promoter element (human cytomegalovirus enhancer, chicken ß actin gene promoter) controls transcription of the target sequences. The respective ORFs encoding the membrane glycoproteins of Nigeria 75/1 vaccine strain and field isolate Kurdistan 2011 were integrated into pCAGGS and their expression was analyzed after transfection using the monospecific sera. The results showed that the respective proteins were expressed in reasonable amounts and integrated into the cell membranes of the transfected cells, providing the prerequisite for future work to develop novel diagnostic tools based on PPRV F and H.

keywords

Peste des petits ruminants virus (PPRV), haemagglutinin, fusion, protein, Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (PPRV), Hämagglutinin, Fusionprotein

kb

14.285