Dissertation

Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

 Bianca Ahlfänger

 

 Untersuchungen zu den Effekten einer exokrinen Pankreasinsuffizienz auf das Längenwachstum und den histologischen Aufbau des Dünndarmes junger Schweine

 

NBN-Prüfziffer

urn:nbn:de:gbv:95-108845

title (engl.)

Investigations on influences of an exocrine pancreatic insufficiency on the length and the histological morphology of the small intestine in young pigs

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2016

text

http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/ahlfaengerb_ws16.pdf

abstract (deutsch)

Die pankreatische exokrine Insuffizienz (PEI) tritt bei erwachsenen Menschen v.a. als Folge einer chronischen Pankreatitis (CP) und bei Mukoviszidose-Kindern auf. Im Rahmen einer vorangegangen Dissertation (SCHWARZMAIER 2012) und darauffolgenden Studien (MÖSSELER et al. 2014, 2015b) zeigten sich bei pankreasgangligierten Schweinen ohne Enzymsubstitution eine deutliche Längenzunahme des Dünndarms um bis zu sechs Meter innerhalb von zehn Wochen sowie erhöhte GLP-2 Serumwerte. Ziel dieser Arbeit war die Klärung der Kernfragen, welche Dünndarmabschnitte reagieren (ob z.B. das Dünndarmwachstum proportional erfolgt) und ob die verschiedenen Schichten der Darmwand (Tunica mucosa, Tunica muscularis) von der Elongation gleichermaßen betroffen sind. Für die Untersuchung standen Gewebeproben aus einer vorangegangenen Studie (MÖSSELER et al. 2015b) zur Verfügung, in der 19 juvenile Hausschweine in vier Gruppen eingeteilt waren: eine Kontrollgruppe mit vier Tieren, die im Alter von sieben Wochen einer Schein-OP unterzogen wurden, eine PL7 Gruppe mit zehn Tieren, bei denen in der siebten Lebenswoche der Pankreasgang ligiert wurde und wovon fünf dieser Tiere ab der neunten Lebenswoche zusätzlich zum Alleinfutter eine orale Vitaminsubstitution erhielten (PL7 VIT Gruppe) und eine PL16 Gruppe mit fünf Tieren, deren Pankreasgang erst im Alter von 16 Wochen ligiert wurde. Anhand histologischer Merkmale wurden die Gewebeproben aller Tiere dem entsprechenden Darmabschnitt zugeordnet. Dadurch konnte eine erste Einschätzung über die von der Elongation betroffenen Dünndarmabschnitte getroffen werden. Im Anschluss erfolgte die Bestimmung der Schichtdicken der Tunica mucosa und Tunica muscularis des Jejunums aller Tiere. Daran schloss sich die immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper gegen PCNA zur Bestimmung von proliferierenden Zellen in den Krypten der Tunica mucosa des Jejunums an. Es wurde außerdem eine immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper gegen Chromogranin A zum Nachweis von enteroendokrinen Zellen (EECs) in der Tunica mucosa des Jejunums durchgeführt. Im folgenden zweiten Teil dieser Arbeit wurde die aus dem ersten Teil noch offen gebliebene Frage, welcher Dünndarmabschnitt mit einer Elongation reagiert, näher untersucht. Dazu wurden acht weibliche Schweine im Alter von 16 Wochen in 2 Gruppen eingeteilt. Bei fünf Tieren wurde in der 16. Lebenswoche der Ausführungsgang des Pankreas ligiert (= PL16 Gruppe) und dadurch eine PEI induziert. Die drei gesunden Tiere der Kontrollgruppe wurden in der 16. Lebendwoche einer Schein-OP unterzogen und gemeinsam mit den Tieren der Versuchsgruppe eingestallt. In der 26. Lebenswoche erfolgte die Sektion aller Tiere. Hierbei wurden die Längen und Massen der einzelnen Dünndarmabschnitte bestimmt und Gewebeproben aus Duodenum, Jejunum, Ileum und Caecum entnommen. Anhand der gewonnenen Gewebeproben wurde die Anzahl an Zellkernen innerhalb einer definierten Fläche (40 x 40 µm) im Stratum circulare und Stratum longitudinale der Tunica muscularis im Duodenum, Jejunum und Ileum bestimmt. Ergebnisse: Die Zuordnung vorliegender Gewebeproben aus einer zuvor durchgeführten experimentellen Studie ließ eine Elongation des Jejunums vermuten. Die Schichtdicken der Tunica mucosa und der Tunica muscularis des Jejunums von Tieren der PL-Gruppen ergaben keine signifikanten Unterschiede zu den Kontrolltieren. Es zeigten sich sogar tendenziell höhere Werte in der Schichtdicke der Tunica mucosa und Tunica muscularis des Jejunums der Tiere der PL7 VIT Gruppe. In der immunhistochemischen Färbung mit dem PCNA-Antikörper konnte ein signifikant höherer Anteil PCNA-positiver Zellen zur Gesamtzellzahl in den Krypten der Tunica mucosa des Jejunums von Tieren der PL7 VIT und der PL16 Gruppe im Vergleich zu den Tieren der Kontrollgruppe nachgewiesen werden. Die Anfärbung der EECs mit Hilfe des Chromogranin A-Antikörpers ergab eine signifikant höhere Anzahl von EECs je Gesichtsfeld in der Tunica mucosa von Kontrolltieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte die schon zuvor beobachtete Elongation des Jejunums bestätigt werden. Dabei zeigte sich im Zeitraum von zehn Wochen eine Längenzunahme des Jejunums der PL16 Tiere im Mittel um circa fünf Meter (20%) im Vergleich zu den Kontrolltieren. Die Länge des gesamten Dünndarmes betrug bei den Tieren der PL16 Gruppe im Mittel 25,7 m und bei den Tieren der Kontrollgruppe 20,6 m. Das Jejunum hatte bei Tieren der PL16 Gruppe eine Länge von 24,6 m und bei Tieren der Kontrollgruppe eine Länge von 19,7 m. Die Länge des Duodenums, Ileums und Colons unterschied sich nicht zwischen den beiden Tiergruppen. Die Tiere der PL16 Gruppe zeigten einen stärker gefüllten GIT im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dies wurde durch eine signifikant höhere Masse an Digesta sowie durch einen hohen Gehalt an Gas verursacht. Darüber hinaus zeigten die Tiere der PL16 Gruppe eine signifikant geringere Verdaulichkeit (sowohl praecaecal als auch über den gesamten Verdauungstrakt) bezüglich Rohprotein und Rohfett. Die Auswertung der Zellkernanzahl innerhalb einer definierten Fläche (40 x 40 µm) im Stratum circulare und Stratum longitudinale der Tunica muscularis ergab eine signifikant niedrigere Zellkernanzahl in Stratum circulare des Duodenums, Jejunums und Ileums der Tiere der PL16 Gruppe sowie eine signifikant niedrigere Zellkernzahl im Stratum longitudinale des Jejunums und Ileums der Tiere der PL16 Gruppe im Vergleich zu den Tieren der Kontrollgruppe. Schlussfolgerungen: Die PEI hat eine reduzierte Nährstoffverdaulichkeit im praecaecalen Bereich sowie über den gesamten Verdauungstrakt (Ausnahme: Stärke) zur Folge. Damit verbunden ist eine stärkere Füllung des GIT mit Digesta, hauptsächlich im Jejunum, Ileum und Colon. Anhand dieser Ergebnisse ist eine vermehrte Anflutung nicht absorbierter Nährstoffe (vor allem Fette) im Dünndarm abzuleiten. Im Ileum befindet sich eine hohe Anzahl von enteroendokrinen L-Zellen, welche durch die Nährstoffkonzentration im Lumen vermutlich angeregt werden, GLP-2 zu sezernieren. GLP-2 ist als Wachstumsfaktor bekannt, sodass die wiederholt beobachtete Dünndarm-Elongation damit erklärt werden könnte. Es konnte gezeigt werden, dass es bei jungen Schweinen mit einer PEI zu einer Elongation des Jejunums kommt und diese aber nicht durch eine Streckung der Tunica muscularis bedingt ist. In Relation zur Dünndarmlänge wiesen die Leermassen des Dünndarmes keine Unterschiede zwischen den Tieren der PL16 Gruppe und den Tieren der Kontrollgruppe auf. Daher stellt die Elongation des Dünndarmes keine „Streckung“ des Darmes dar, sondern eine vermehrte Synthese von Darmgewebe. Genauer gesagt, kommt es (bei PL16 Tieren) zu einer Hypertrophie der glatten Muskelzellen in der Tunica muscularis. Bei Tieren, deren Pankreasgang schon früh, d.h. in der siebten Lebenswoche ligiert wurde, sprechen die Befunde hingegen eher für eine Hyperplasie der glatten Muskelzellen in der Tunica muscularis, und zwar aufgrund der in diesem Alter noch recht hohen Plastizität der Muskulatur. Dies kann aber abschließend nicht mit Sicherheit gesagt werden, dazu bedarf es weiterer Untersuchungen. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass es im Falle einer durch eine PEI ausgelösten Dünndarmelongation weder zu einer Hypertrophie noch zu einer Atrophie der Tunica mucosa des Jejunums kommt, sondern die Tunica mucosa in ihrer Schichtdicke und ihrem Aufbau absolut unbeeinflusst bleibt. In den Krypten der Tunica mucosa des Jejunums zeigten sich im Vergleich zu den Kontrolltieren bei den Tieren der PL7 VIT und PL16 Gruppe (die Gruppen mit der höchsten Dünndarmlänge) mehr teilungsaktive Zellen. Dies lässt vermuten, dass die Tunica mucosa auf die Verlängerung des Dünndarmes mit einer ganz physiologischen Entwicklung reagiert und es zu keiner, durch Streckung bedingten, geringeren Schichtdicke kommt.

abstract (englisch)

The exocrine pancreatic insufficiency (EPI) occurs in adult humans as a result of a chronic pancreatitis and in children suffering from cystic fibrosis. In a former thesis (SCHWARMAIER 2012) and following studies (MÖSSELER et al. 2014; 2015b) an elongation of the small intestine up to six meters within ten weeks and high GLP-2 serum levels were shown in pigs with an untreated pancreatic duct ligation. This study was designed to clarify the unanswered question, which part of the small intestine reacts with an elongation (does the small intestine react in toto) and if the different layers of the small intestine (tunica mucosa, tunica muscularis) are affected by the elongation equally. Therefore, tissue samples from a former study (MÖSSELER et al. 2015b) were examined histologically. It contained 19 female pigs, divided into four groups: one control group with 4 animals, which were sham-operated when aged seven weeks, a PL7 group with ten animals, which underwent surgery when aged seven weeks - 5 animals of this group got an oral vitamin supply from life week nine onwards (PL7 VIT) - and a PL16 group with five animals, whose pancreatic duct was ligated when aged 16 weeks. With the produced tissue slices, the tissue samples of all animals were assigned to the corresponding section of the small intestine, thereby creating a first overview of the small intestine sections affected by the elongation. This was followed by measuring the layer thickness of the jejunal tunica mucosa and tunica muscularis of all animals. Afterwards, an immunohistochemical staining with antibodies against PCNA was performed to determine the proliferating cells in the crypts of the jejunal tunica mucosa. For the detection of enteroendocrine cells (EECs) in the jejunal tunica mucosa, an immunohistochemical staining with antibodies against chromogranin A was performed. In the subsequent second part of this study, the unanswered question of the first part as to which portion of the small intestine reacts with an elongation, was investigated. Therefore, eight female pigs (aged 16 weeks) were divided into two groups. In the five animals of the PL16 group the excretory duct of the pancreas had been ligated in life week 16 and thereby an EPI was induced. The three animals of the control group underwent a sham-op in life week 16 and were stabled together with the pancreatic duct ligated animals. The necropsy of all animals was performed in life week 26. In the dissection, the lengths and the masses of the individual small intestine segments were determined and tissue samples were taken from the duodenum, jejunum, ileum and caecum. On the basis of new tissue samples, the number of cell nuclei within a defined area (40 x 40 µm) was determined in the stratum circulare and stratum longitudinale of the tunica muscularis in the duodenum, jejunum and ileum. Results: The assignment of the tissue samples from the first part of this study to the corresponding section of the small intestine hypothesised an elongation of the jejunum. There were no significant differences of the jejunal layer thickness (tunica mucosa/tunica muscularis) between the animals of the PL-groups and the animals of the control group. However, there were numerically higher values in the layer thickness of the tunica mucosa and tunica muscularis of the jejunum of the animals of PL7 VIT group. An immunhistochemical staining using a PCNA antibody was performed to identify proliferating cells in the crypts of the jejunal tunica mucosa. A higher percentage of PCNA-positive cells to the total crypt cell number was shown in animals of the PL7 VIT and PL16 group compared to the animals of the control group. The staining of the EECs using the chromogranin A antibody showed a significantly higher number of EECs per field of view in the tunica mucosa of the control animals. In the second part of this study the previously mentioned elongation of the jejunum was confirmed. In this case, an increase in length of the jejunum of the animals of the PL16 group by an average of five meters (20%) compared to the animals of the control group was observed. The length of the duodenum, ileum and colon did not differ between the two groups. The animals of the PL16 group showed a higher gut fill compared to the control group. This was caused by a significantly higher mass of digesta as well as a high content of gas. Additionally, the animals of the PL16 group had a significantly lower apparent ileal digestibility and a significantly lower apparent digestibility throughout the entire digestive tract regarding crude protein and crude fat. The evaluation of cell nuclei within a defined area (40 x 40 µm) in the stratum circulare and stratum longitudinale of the tunica muscularis showed a significantly lower number of nuclei in the stratum circulare of the duodenum, jejunum and ileum of the animals of the PL16 group as well as a significantly lower number of nuclei in the stratum longitudinale of the jejunum and ileum of the animals of the PL16 group compared to the animals of the control group. Conclusion: The EPI causes a lower nutrient digestibility in the praecaecal region and throughout the entire digestive tract (except carbohydrates). This is associated with a higher gut filling, mainly in the jejunum, ileum and colon. Based on these results, an increased influx of unabsorbed nutrients (particularly fats) is expected in the ileum. Here, high numbers of enteroendocrine L-cells were identified, which are stimulated by high nutrient density in the lumen to secrete GLP-2. GLP-2 is known as a growth factor and this might explain the repeatedly observed elongation of the small intestine. It has been shown that in pigs an EPI results in an elongation of the jejunum and that this is not due to muscular thinning or limp of the tunica muscularis. In relation to the small intestine length, the empty weight of the small intestine showed no difference between the animals of the PL16 group and the control group. Thus, the elongation of the small intestine is not an “extension” of the intestine, but an increased synthesis of intestinal tissue. Rather, in animals of the PL16 group a hypertrophy of the smooth muscle cells of the tunica muscularis occurred. In animals whose pancreatic duct was ligated early in life (in the 7th week of life), it probably comes to a hyperplasia of the smooth muscle cells of the tunica muscularis, because of the still high plasticity of these cells in this age. But this cannot conclusively be said with certainty. There is a need for further investigations. Also, it has been shown, that in case of EPI, there is neither a hypertrophy nor an atrophy of the tunica mucosa of the jejunum. However, the animals of the PL7 VIT and PL16 group (both groups had the highest small intestine length) showed a higher percentage of proliferating cells in the crypts of the jejunal tunica mucosa compared to the control animals. This suggests that the tunica mucosa reacts to the elongation of the small intestine with a “physiological growth” and architecture and not with a “thinning”.

keywords

pancreas, EPI, pig/ Schwein, Pankreas, PEI

kb

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