Dissertation
Tierärztliche Hochschule Hannover / Bibliothek – School of Veterinary Medicine Hannover / Library

 

Birgit Ackermann

 

Molekulargenetische Untersuchungen zum Nitratstoffwechsel

und diagnostischen Nachweis von Mykobakterien

 

title (engl.)

Examination of nitrate metabolism in Mycobacteria and of diagnostic means to detect Mycobacteria on the molecular level

publication

Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation, 2001

text

/dissertations/ackermannb_2001.pdf

abstract (orig.)

Viele Mykobakterien besitzen die Fähigkeit, Nitrat zu Ammonium zu reduzieren, welches als alternative Stickstoffquelle genutzt werden kann und somit zur Assimilation dient. Es ist jedoch nicht bekannt, durch welche Gene diese Eigenschaft exprimiert wird und welche Aufgabe sie genau erfüllt.

Im Zuge der in dieser Arbeit dargestellten und diskutierten Untersuchungen ist es gelungen, mit Hilfe von Klonierungsexperimenten einen einzelnen Abschnitt aus dem Genom von M. tuberculosis zu isolieren. Dieser ORF Rv 0818 zeigte bei der Analyse seiner Sequenz eine sehr hohe Homologie zu dem glnR-Gen von Streptomyces coelicolor und entspricht vermutlich dem Regulator GlnR, der die Glutaminsynthetase positiv reguliert. Diese Glutaminsynthetase reguliert wiederum die Gene für die Nitratassimilation positiv.

 

Weiterhin wurde mit Hilfe der Lightcycler-Technologie versucht, eine PCR zur schnellen „Online“-Diagnostik von Mykobakterien zu entwickeln. Der Lightcycler ermöglicht mit seiner Software und der kontinuierlichen Messung von Fluoreszenzsignalen, die in Form einer Schmelzkurvenanalyse ausgewertet werden können, eine besonders schnelle und zuverlässige Detektion von spezifisch amplifizierten Produkten. Es wurden ein 1000 bp-großes genusspezifisches oder ein 300 bp-großes speziesspezifisches Fragment des mykobakteriellen 16S rRNA-Gens amplifiziert. Das 16S rRNA-Gen ist besonders gut geeignet, da auf ihm sowohl genusspezifische als auch speziesspezifische Bereiche hoch konserviert sind, so dass eine Zuordnung bestimmter Sequenzen zu einer Art oder Spezies leicht möglich wird. Das 1000 bp-große Fragment wurde mit einem für den Genus „Mycobacterium“ spezifischen Primer- und zusätzlichen Sondenpaar zuerst amplifiziert und in derselben Reaktion auch hybridisiert. Dabei wurde zwar DNA von M. bovis BCG bis zu ca. drei Kopien zuverlässig detektiert, aber bei den anderen Mykobakterienspezies wurde nur eine wesentlich geringere Sensitivität erzielt.

Die Spezifität der genusspezifischen Reaktion war mangelhaft, da auch mit Mykobakterien eng verwandte Arten, wie z.B. Nocardien, mitamplifiziert wurden. Die Spezifität der speziesspezifischen Reaktion dagegen war sehr gut, da weder mit Mykobakterien eng verwandte Arten noch andere Mykobakterienspezies von dem speziesspezifischen Primer- und Sondenpaar detektiert wurden. Lediglich DNA von M. bovis BCG wurde zuverlässig detektiert, allerdings nur mit einer Sensitivität zwischen ca. 30-300 Kopien.

Insgesamt stellen die Versuche auf dem Lightcycler einen wichtigen Schritt zur Nutzung moderner Technologien dar, die eine viel schnellere Diagnose von Infektionskrankheiten auf molekularer Ebene erlauben.

 

 

abstract (engl.)

Many mycobacteria are able to reduce nitrate to ammonium which can then be used as an alternative nitrogen-source for assimilatory processes. However, it is not clear which genes confer to this ability and what function the assimilatory nitrate reductase fulfils.

In this work, a single ORF from a part of the M. tuberculosis-genome was cloned. This ORF, named Rv 0818, revealed to be highly homologous to the glnR-gene of Streptomyces coelicolor and is most likely GlnR, which positively regulates the glutaminsynthetase (GS). GS positively regulates genes for nitrate assimilation.

 

Furthermore, we used Lightcycler technology for the fast online detection of mycobacteria. The Lightcycler technology allows a continuous detection of fluorescence signals, that can be interpreted by melting curve analysis with the specific Lightcycler software. This offers an extremely fast and reliable method to detect specifically amplified PCR-products.

A 1000 bp-sized fragment of the 16S rRNA-gene that included regions specific for the genus “Mycobacterium” and regions specific for the species “M. tuberculosis” or a 300 bp-sized fragment that contained only species-specific regions were amplified. The use of the 16S ribosomal RNA-gene as a template for PCR is of great advantage because it contains highly conserved regions of genus specificity and species specificity so you can easily identify DNA of a certain genus or species.

The 1000 bp-sized fragment was amplified with one primer pair and in the same experiment hybridized to a pair of probes, all specific for the genus “Mycobacterium”. In this PCR, the sensitivity in detecting BCG-DNA was very high because it was possible to detect as few as about three bacteria. But with other mycobacterial DNA, the sensitivity was 10 to 104 fold lower. The specifity was not satisfying, too, because the PCR gave not only positive results when amplifying mycobacterial DNA, but also when DNA of closely related genera such as Rhodococcus, Nocardia or Corynebacterium was used as a template.

In contrast, the specificity of the species-specific PCR with the amplification of a 300 bp-sized fragment was very good because not only no related genera were amplified but also none of the mycobacterial DNAs other than BCG-DNA gave positive results with the species-specific primers and probes. BCG-DNA was detected successfully up to 30-300 copies, which represents a sensitivity that is somewhat lower as compared to the sensitivity of the genus-specific PCR.

In summary, the experiments with the Lightcycler-PCRs provide an important step in using future modern technology that allow a much faster diagnosis of infectious diseases on the molecular level.

 

keywords

Mykobakterien, Nitrat, PCR, mycobacteria, nitrate

kb

1.068